דו"ח מדעי מסכם של תכנית 362-0132-08

הממומנת ע"י הנהלת ענף בקר

 

זיהוי מצבי עקבה בפרות במרעה באמצעות מערכת חלבוני עקת חום

 

מגישים: אריאל שבתאי, אריה ברוש, זלמן הנקין ויואב אהרוני

 

 

תקציר:

רב עדרי הבקר לבשר בארץ מוחזקים במשטר הזנה אקסטנסיבי. מדובר בעדרים מעורבים שגזע הסימנטל הוא דומיננטי בהם. סימנטל הינו גזע בעל כושר יצרנות גבוה. בכל הקשור לביצועי מערכות החיסון והרבייה, וכפועל יוצא שלהן - לשיעור הגמילה האפקטיבית של עגלים בעדר, טיפוח ליצרנות גבוהה יכול להוות חסרון בבתי גידול ים תיכוניים, המאופיינים באסימטריה עונתית ובאיכות ירודה של המרעית משך כשמונה חודשים בשנה. ואכן, במהלך עשרים השנים האחרונות חלה ירידה של למעלה מעשרים אחוז בשיעור הגמילה האפקטיבית של עגלים בעדר הבשר, מבלי שהסיבה לכך ידועה. ההנחה הבסיסית שלנו היא כי העדרים חווים רמות וסוגים שונים של עקה, המשפיעים בין היתר על ביצועי מערכות הרבייה והחיסון שלהם.

בתקופת המחקר התמקדו בתגובה לעקת אנרגיה ולעקת חלבון בפרות סימנטל מניקות והרות, בהתאמה. בעקת אנרגיה, בחננו את התגובות לעקה מההיבט של ייצור החלב ואיכותו ומההיבט של ביטוי גנים בדם ובתאים הסומטיים בחלב. בעקת חלבון, עקבנו אחר תגובות ברמה הפיסיולוגית, הביוכימית והמולקולרית, כדי לנסות ולפתח אינדקס שבעזרתו, מצד אחד, נוכל לבחון עדרים, ומצד שני, נוכל לאתר פרטים בתוך עדר שעמידים יותר לעקת חלבון, כפוטנציאל להשבחת העדר לתכונה זאת.

ייצור חלב ע"י אמהות מניקות בעדרי הבקר לבשר נחשב לגורם העיקרי המשפיע על שיעור הגדילה של העגלים עד לגמילה. בנוסף להשפעתו על ביצועי העגל, לייצור החלב יש השלכות ניכרות על הדרישות התזונתיות של הפרות ובכך משפיע בעקיפין גם על שיעור ההתעברויות הבאות שלהן.

החלבון שבמזון הינו המרכיב המגביל החשוב ביותר לניצול של מספוא באיכות ירודה ע"י מעלי גירה. לאור זאת, ומאחר וריכוז נמוך של חלבון במנה עשוי לגרום להפרעות מטבוליות בפרות ועובריהן, קיים צורך לפתח הערכות אנליטיות להערכת התגובות לתזונה במזון עני בחלבון.

התוצאות מלמדות, כי בשונה מפרות מניקות מגזעי בקר לבשר אחרים, השומרות על מסת גופן על חשבון הורדת ייצור החלב, פרות סימנטל מאבדות משקל ומורידות את ייצור החלב גם יחד. הן מפצות במידה מסוימת על הירידה בייצור החלב בהעלאת אחוז השומן שלו ובשינוי הפרופורציה של חומצות השומן בחלב, עם עדיפות ברורה לחומצות שומן ארוכות ולא-רוויות שלהן ערך אנרגטי גדול יותר. בשונה ממערכות ניסוייות אחרות המציינות עלייה בביטוי Hsp70 כגורם המתווך את ההשפעה המועילה של עקת אנרגיה, התגובה של Hsp70 במחקר הנוכחי הייתה תלוית סוג תא. בעוד שרמות הביטוי של Hsp70 ו Hsp90 בדם לא הושפעו כמעט (מעט עלו) מעקת האנרגיה, בתאים הסומטיים ביטוי Hsp70 בעקבות העקה ירד באופן ניכר. על חשבון ירידה זאת ניכרה עלייה משמעותית בביטוי של as1-casein ו FABP. as1-casein ידוע כקושר קלציום פוספט להבטיח את אספקת סידן לפרט היונק, ואילו FABP נקשר לחומצות שומן באפיניות גבוהה, ומשתתף בהעברה שלהן מהדם לאפיתל העטין. הדגם הזה, של ירידה בביטוי Hsp70 ועליה רציפרוקלית בביטוי as1-casein ו FABP יכולה ללמד על שינוי בתכנית הביטוי של חלבונים ברקמת העטין, שמטרתו לספק לעגל את דרישותיו התזונתיות להתפתחות תקינה.

גם במקרה של עקת החלבון, נצפתה ברקמת השומן התת-עורי ירידה בביטויים של Hsp70 ו Hsp90, כמו גם בביטוי של תת היחידה C2 של הפרוטאזום. במקביל, חלה עליה מובהקת בביטוי FABP. עקת החלבון גרמה לירידה בצריכת המזון וקצב הלב ולמאזן אנרגיה שלילי, אך לא השפיעה על משקל הגוף והמצב הגופני של הפרות.

הממדים אותם בחננו בפרות סימנטל בתקופת המחקר יכולים לשמש ליצירת אינדקס שבעזרתו נוכל לבחון התאמתם של גזעים נוספים ופרטים בתוך עדר נתון לתנאי המרעה בארץ.

 

מבוא:

אחת מהסיבות המרכזיות לרווחיות הנמוכה בענף הבקר לבשר במרעה היא הירידה המתמשכת בשיעורי הגמילה, קרי ביצרנות, גם בעדרים המנוהלים ברמת ממשק גבוהה. שיעור הגמילה הנמוך נובע, בין היתר, מאובדן שגר במהלך ההיריון ולאחר ההמלטה, ומהחשיפה של הפרטים בעדר לגורמי תחלואה שונים, למחסור במרכיבים תזונתיים ולאתגרים אקלימיים. המתאם השלילי ההדוק שבין יעילות הייצור ותנאי עקה סביבתיים ידוע ממערכות שונות של חיות משק (Yahav and Hurwitz, 1996; Dahl and Petitclerc, 2003; Shabtay and Arad, 2005).

רב עדרי הבקר לבשר בארץ, המוחזקים במשטר הזנה אקסטנסיבי, הם עדרים מעורבים שגזע הסימנטל הוא דומיננטי בהם. סימנטל הינו גזע בעל כושר יצרנות גבוה. בכל הקשור לביצועי מערכות החיסון והרבייה, וכפועל יוצא שלהם - לשיעור הגמילה האפקטיבית של עגלים בעדר, טיפוח ליצרנות גבוהה יכול להוות חסרון בבתי גידול ים תיכוניים המאופיינים באסימטריה עונתית ובאיכות ירודה של מרעית משך כשמונה חודשים בשנה (Main, 1986; Sternberg et al., 2000).

ייצור חלב ע"י אמהות מניקות בעדרי הבקר לבשר נחשב לגורם העיקרי המשפיע על שיעור הגדילה של העגלים עד לגמילה (Meyer et al,. 1994). בנוסף להשפעתו על ביצועי העגל, לייצור החלב יש השלכות ניכרות על הדרישות התזונתיות של הפרות ובכך משפיע בעקיפין גם על שיעור ההתעברויות הבאות שלהן

(Mallinckrodt et al., 1993). שומן, ובמיוחד חומצות השומן הארוכות, נחשבות למרכיב העשיר באנרגיה של החלב. הייצור של שומן חלב ע"י רקמת העטין דורש כמויות גדולות של חומצות שומן שהמקור שלהן הוא ייצור אנדוגני בעטין (חומצות שומן קצרות) וספיגה מהדם של חומצות השומן הארוכות יותר, שהמקור שלהן הוא המזון ורקמת השומן (Dils, 1983).  

חוץ ממרכיבי החלב העיקריים (שומן, לקטוז, קזאין), החלב מכיל גם תאים סומטיים (תאי אפיתל ולויקוציטים). תאי האפיתל בחלב בקר הם תאים חיים ומבחינת ביטוי גנים, יכולים לייצג נאמנה את אפיתל רקמת העטין (Boutinaud et al., 2002; Buehring, 1990; German and Barash, 2002).

החלבון שבמזון הינו המרכיב המגביל החשוב ביותר לניצול של מספוא באיכות ירודה ע"י מעלי גירה (Siebert and Hunter, 1982), בגלל אספקה נמוכה של חנקן לחיידקי הכרס (Arieli et al., 1989; (1993. במהלך ההיריון מזון דל בחלבון יכול לגרום לתכנות עוברים הגורם להפרעות מטבוליות ומודולציות פיסיולוגיות עם השפעות מזיקות על מערכת החיסון (Langley-Evans et al., 1994, 1997).

הקשר שבין תגובת הפרה לעקות אנרגיה וחלבון יכול ליצור אינדקס של מותאמות של גזע פרות בשר לבית הגידול שלו, כמו גם ליצור יכולת לאבחן פרות מותאמות בתוך עדר למטרות סלקציה.

 

מטרות המחקר:

1. לבחון את התגובה של פרות בשר לעקות אנרגיה וחלבון ברמה הפיסיולוגית, הביוכימית והמולקולרית.

2. לבחון את מעורבות חלבוני העקה בעקות הנ"ל.

2. להרכיב אינדקס שיוכל לשמש לאיתור הבדלים בין גזעים ופרטים בתוך עדר עם עמידויות לרמות חלבון ואנרגיה נמוכות.

 

שיטות וחומרים:

א. עקת אנרגיה - 10 פרות סימנטל מניקות ובהריון מעדר המחקר של נוה יער שמשו בניסוי זה. כל הפרות היו בהיריון שלישי עד חמישי. פרות הביקורת (n=4) הוזנו במנה שהכילה 11.5% חלבון כללי ו 1.9מ"ק לק"ג ח"י. פרות הניסוי (n=6) הוזנו במנה שהכילה 7% חלבון כללי ו 1.45מ"ק לק"ג ח"י. הניסוי נמשך שלושה חודשים, והגיל הממוצע של העגלים היה חמישה וחצי חודשים. לעגלים הייתה גישה חופשית לבליל יונקים (קריפ). ייצור החלב נמדד בשיטת weigh suckle weigh. העגלים הופרדו למשך 16 שעות מהפרות וההפרש בין משקל העגלים לפני ואחרי היניקה תוקן ל 24 שעות. אירוע היניקה, לאחר המפגש של העגלים והפרות נמשך כשלושים דקות, במהלכן וידאנו שלא היו הפרשות צואה ושתן מהעגלים. לצורך בדיקת מרכיבי החלב הפרות נחלבו ידנית ואנליזות של שומן, חלבון, אוריאה ולקטוז התבצעו במעבדה המרכזית לחלב באמצעות מכשיר Milkoscan FT6000; Foss Food Technology Corp. DK (AOAC 1990). הרכב חומצות השומן בחלב נקבע באמצעות מכשיר GC-FIDעל בסיס סטנדרדים ידועים. כדי לקבל תאים סומטיים מהחלב, דוגמאות חלב (כ 200 מ"ל) סורכזו בקור ונשטפו מספר פעמים ב PBS קר בנוכחות 0.5mM EDTA.

דם נדגם מוריד הזנה של הפרות בעזרת ואקוטיינר שהכיל EDTA כנוגד קרישה. התאים הלבנים הופרדו ע"י סרכוז ונוקו משאריות תאים אדומים באמצעות ליזיס דיפרנציאלי של אריתרוציטים.

Hsp70, Hsp90, actin זוהו במיצויים של לויקוציטים ותאים סומטיים באמצעות נוגדנים ספציפיים. הזיהוי של as1-casein התבצע בעזרת mass spectrometry analysis. מעקב אחר הביטוי של FABP בתאים הסומטיים התבצע ע"י RT-PCR.

ב. עקת חלבון – 6 פרות סימנטל בחודש השלישי להיריון, בגיל ממוצע של שש שנים שמשו בניסוי זה. הפרות הוחזקו בתאים פרטניים להערכת צריכת מזון אינדיבידואלית. צריכת מזון פרטנית של מנת הביקורת נמדדה במשך שבוע, לאחר תקופה בת שבועיים של אקלום לתאים הפרטניים. מיד אח"כ שונתה המנה למנת ניסוי (6% חלבון כללי במקום 12%; טבלה 2). צריכת המזון הפרטנית של מנת הניסוי נקבעה במשך שבוע אחרי שלושה שבועות ושלושה חודשים של הזנה. מנת הביקורת והניסוי היו איזו-קלוריות. חלבון כללי נקבע על סמך AOAC (1990). האנרגיה המטבולית חושבה על פי NRC (2001). כדי לשלול את השפעת ההתקדמות בהיריון על הפרמטרים הנמדדים, 4 פרות נוספות שימשו כקבוצת "ביקורת הריון". קבוצה זאת הוזנה משל כל שלושת חודשי הניסוי במנת ביקורת, ונדגמה במקביל לפרות הניסוי לפרמטרים השונים.

ביופסיות של שומן תת-עורי נלקחו מהפרות תחת טשטוש מקומי (Esrakain; Lidocaine hydrochloride 2%; RAFA LABORATORIES LTD, Israel) בתיחלת הניסוי ובסופו, כדי לעקוב אחר הביטוי של Hsp, C2-Proteasome sub-unit ו A-FABP. דם נדגם מוריד הזנב לצורך אנליזה של אוריאה (PUN), בטא-הידרוקסי בוטיראט (BHBA), קריאטינין (CREA) וחומצות שומן חופשיות (NEFA) בפלסמה.

הוצאת האנרגיה נמדדה בשיטת קצב הלב (HR-O2P) ע"פ Brosh וחובריו (1998, 2002, 2004). על בסיס שיטה זאת חושבה גם הוצאת האנרגיה ובשילוב עם נתוני צריכת המזון גם מאזן האנרגיה של כל פרה.

ביטוי Hsp ו C2-Proteasome sub- unit נקבע בשיטת Western blot ואילו הביטוי של A-FABP נקבע באנליזת Mass Spectrometry.

 

תוצאות + דיון:

עקת אנרגיה - בתום תקופת הניסוי תוספת המשקל של עגלי הביקורת 49±2.7) ק"ג) הייתה גבוהה יותר משל עגלי הניסוי 34.7±10.6) ק"ג), אך לא הייתה שונה באופן מובהק בגלל השונות הגבוהה (t8=1.31, p=0.241). גם אובדן המשקל של הפרות לא היה אחיד (7-100 ק"ג) בהשוואה לעלייה קלה במשקל פרות הביקורת (2 ק"ג). כפי שמוצג באיור 1, קיים קשר לינארי מובהק (r=0.75, p=0.04) בין הירידה במשקל הפרות לתוספת המשקל של עליהן בתום תקופת הניסוי.

 

 

איור 1: הקשר בין אחוז הירידה במשקל של פרות בשר מניקות בעקת אנרגיה לבין תוספת המשקל של עגליהן.

 

 

איור 2: השפעת עקת אנרגיה בת שלושה חודשים על פוטנציאל ייצור החלב של פרות סימנטל.

 

 

כפי שעולה ממבחן weigh suckle weigh חלה ירידה של פי 4 בפוטנציאל ייצור החלב של פרות בעקת אנרגיה ממושכת (איור 2). השילוב של התוצאות הנ"ל והשוואה למחקרים בגזעי בקר אחרים

(Lalman et al., 2000; Jones and Garnsworthy, 1989), שהראו כי בעקת אנרגיה פרות מניקות שומרות על משקל גופן אך מפחיתות את ייצור החלב, עשויה לרמוז כבר בשלב זה, כי יתכן שגזע הסימנטל אינו אופטימאלי לתנאים של מחסור באנרגיה בבית הגידול. למרות זאת, קיימת אפשרות שהפרה מפצה בכל זאת על הירידה בייצור החלב באמצעות שינוי רמת והרכב השומן בחלב. ניתן לראות בטבלה 1 כי חלה עלייה מובהקת בת 1.2% בשומן החלב בעקבות עקת האנרגיה.

 

טבלה 1: השפעת עקת אנרגיה על הרכב החלב של פרות סימנטל מניקות

 

בנוסף לעלייה באחוז השומן בחלב גם הפרופורציה של חומצות השומן בשומן החלב השתנתה באופן מובהק בעקבות עקת האנרגיה. כפי שנראה באיור 3, עקת האנרגיה גרמה לירידה מובהקת בריכוז חומצות השומן הקצרות short FA)) והרוויות (SFA), ולעלייה מובהקת בריכוז חומצות השומן הלא-רוויות (MUFA) והרב אל-רוויות (PUFA).

באופן מעניין, נמצא מתאם שלילי מובהק בין אחוז תוספת המשקל של העגלים לבין SFA (r=-0.975, p=0.0001, n=6), ומתאם חיובי מובהק בין אחוז תוספת המשקל של העגלים לבין MUFA (r=0.915, p=0.011, n=6). כפי שמופיע באיור 3, SFA ו MUFA מהוות חלק ניכר משומן החלב. אולם העובדה שהן מצויות במתאם עם הגדילה של העגלים באופן המיוחד הזה, מצביעה להבנתנו, על תגובה פיסיולוגית לעקת אנרגיה, שמטרתה לפצות על הירידה בייצור החלב בתוספת אנרגיה בשומן שלו.

 

איור 3: השפעת עקת אנרגיה בת שלושה חודשים על הרכב שומן החלב של פרות סימנטל. עמודות אפורות – ביקורת, עמודות לבנות – עקת אנרגיה.

 

מספר אנזימי מפתח משתתפים בבקרת היצירה של שומן החלב בפרות. כאשר מבצעים מניפולציות הגורמות להורדת שומן החלב, נרשמת ירידה גם בפעילותם וביטויים של אנזימים אלו. אחד מהחלבונים הנ"ל נקרא fatty acid binding protein (FABP). FABP נקשר לחומצות שומן באפיניות גבוהה, ומשתתף בהעברה שלהן מהדם לאפיתל העטין (Simpson et al., 1999). כפי שכבר צוין, אפיתל העטין קולט מהדם חומצות שומן ארוכות, שהפוטנציאל האנרגטי שלהן גבוה יותר משל הקצרות המיוצרות באפיתל העטין. אנו בחנו את ביטוי FABP בתאים סומטיים מהחלב. כפי שניתן לראות באיור 4, עקת אנרגיה מגבירה את הביטוי של FABP בתאים הסומטיים האפיתליאליים.

 

איור 4: השפעת עקת אנרגיה בת שלושה חודשים על ביטוי mRNA של החלבון FABP בתאים סומטיים מחלב של פרות סימנטל מניקות. C – ביקורת, CS- עקת אנרגיה.

 

בהרבה מערכות ניסוייות עלייה בביטוי Hsp70 מצוינת כגורם המתווך את ההשפעה המועילה של עקת אנרגיה (Duffy et al., 1997; Patel and Finch, 2002; Yu and Chung, 2001). אנו עקבנו אחר הביטוי של Hsp70 בדם ובתאים הסומטיים של פרות סימנטל מניקות, בתגובה לעקת אנרגיה. למרות עלייה מינורית בביטוי Hsp70 בדם (איור 5א'), רמת ביטויו בתאים הסומטיים האפיתליאליים יורדת בצורה דרמטית (איור 5ב'). מעניין לציין כי חלבון אחר בתאים הסומטיים, as1-casein מראה תמונת ראי לזו של Hsp70 (איור 5ב').

החלבון as1-casein הוא אחת מהצורות של חלבון החלב קזאין. as1-casein ידוע כקושר קלציום פוספט להבטיח את אספקתו לפרט היונק. הדגם הזה, של ירידה תלוית סוג תא בביטוי Hsp70 ועליה רציפרוקלית בביטוי as1-casein יכולה, שוב, ללמד על שינוי בתכנית הביטוי של חלבונים ברקמת העטין, שמטרתו לספק לעגל את דרישותיו התזונתיות להתפתחות תקינה.

 

איור 5: השפעת עקת אנרגיה בת שלושה חודשים על ביטוי Hsp70 , Hsp90 בתאי דם (פנל א') וביטוי Hsp70 ו as1-casein בתאים סומטיים (פנל ב') מחלב של פרות סימנטל מניקות.

 

א.

 

 

ב.

 

 

 

טבלה 2: הרכב ואנרגיה מטבולית מחושבת של מנות הביקורת והניסוי (% מחומר יבש)

 

עקת חלבון – צריכת החומר היבש 3 שבועות על מנת הניסוי הייתה נמוכה מזו של מנת הביקורת (P < 0.001). לאחר שלושה חודשים על מנת הניסוי, צריכת המזון היבש המשיכה לרדת (P < 0.05, טבלה 3).

 

טבלה 3: השפעת מנה דלת חלבון צריכת המזון היבש (DMI), צריכת האנרגיה (MEI), הוצאת האנרגיה (EE) והמצב הגופני (BCS)של הפרות

∗ האותיות השונות מציינות הבדלים מובהקים בתוך השורות

 

תכולת החלבון במזון המוגש, בשאריות ובצואה מופיעה בטבלה 4. בתגובה למנה דלת חלבון כמות החלבון בשאריות ירדה (P < 0.001). ירידה בכמות החלבון ניכרה גם בצואה – גם כאן במנת הניסוי רמת החלבון הייתה נמוכה יותר (P < 0.001). המצב הגופני של הפרות לא השתנה בהשפעת כמות החלבון במנה (טבלה 3).

 

טבלה 4: תכולת חלבון כללי במזון המוגש, בשאריות ובצואה

∗ האותיות השונות מציינות הבדלים מובהקים בתוך השורות

 

קצב הלב של הפרות, בהזנה על מנת ביקורת היה 70.1 ± 4.6 פעימות\דקה. כעבור שלושה שבועות על מנה דלת חלבון קצב הלב ירד ל 59.1 ± 4.4 פעימות\דקה (P < 0.05) והמשיך לרדת ל 57.6 ± 5.7 (P < 0.001) כעבור שלושה חודשים על מנת הניסוי. למרות זאת, התבנית היממתית של קצב הלב לא הושפעה מהורדת רמת החלבון במנה (איור 6).

 

איור 6: קצב הלב היומי הממוצע של פרות כפונקציה של רמת החלבון במזון. LPD – מנה דלת חלבון.

 

כדי לשלול את השפעת ההתקדמות בהיריון על קצב הלב, נבחן גם קצב הלב של הפרות בקבוצת "ביקורת ההיריון". קצב הלב היומי הממוצע שלהן (68.9 ± 4 פעימות/דקה) לא נבדל מזה של קבוצת הביקורת

(t8 = 0.43, P > 0.05) או מקצב הלב העצמי שלהן67.4 ± 3.5)  פעימות/דקה), שלושה חודשים קודם לכן

(P > 0.05), אך היה גבוה יותר משל פרות הניסוי שלושה שבועות על מנה דלת חלבון (t8 = 3.55, P = 0.007) ושלושה חודשים על מנה דלת חלבון (t8 = 3.41, P = 0.009).

האנרגיה הנאצרת (retained energy; RE) חושבה מהפחתת MEI מהוצאת האנרגיה EE. בהשוואה לאנרגיה הנאצרת בהזנה על מנת הביקורת (274 ± 44 kJ·MBW·d-1), RE ירד באופן מובהק (P < 0.001) שלושה שבועות (-99 ± 100 kJ·MBW·d-1) ושלושה חודשים (-116 ± 93 kJ·MBW·d-1) בהזנה על מנה דלת חלבון. ראוי לציין כי ב 5 מתוך 6 הפרות מאזן האנרגיה היה שלילי אחרי 3 חודשים על מנת הניסוי (איור 7).

 

איור 7: השפעת מנה דלת חלבון על האנרגיה הנאצרת הפרטנית בפרות. LPD – מנה דלת חלבון.

 

התוצאות המוצגות במחקר הנוכחי מצביעות על כך שבתגובה למנה דלת חלבון הפרות מורידות את הקצב המטבולי שלהן, ושמדידות ההוצאה האנרגתית מסוגלות להעריך בדייקנות התדרדרות בסטטוס האנרגתי של פרות בשר בהריון, שמקורו בירידה ברמת החלבון במזון. עובדה זו באה לידי ביטוי בעיקר כאשר בוחנים את המאזן האנרגתי האינדיבידואלי. למרות שהפרות נבדלות בתבנית ה RE שלהן, ניתן לומר בכלליות כי רמת חלבון נמוכה במזון מעודדת, תוך פרק זמן קצר, מאזן אנרגיה שלילי בפרות בשר בהיריון. ראוי לציין כי פרה מספר 2 (איור 7) לא הגיע למאזן אנרגיה שלילי משך כל הניסוי. אינדיבידואלים כאלה צריכים להיות מושא למחקרים נוספים אם לוקחים בחשבון סלקציה לעמידות לריכוז חלבון נמוך במזון.

 

השפעת רמת החלבון במנה על מדדים ביוכימיים בפלסמה מוצגת בטבלה 5. בעוד שרמות CREA ו NEFA עלו בהדרגה עם משך הניסוי, הן לא נבדלו מרמות הביקורת. בעוד שרמות ה PUN ירדו כעבור 3 שבועות על מזון דל חלבון, אך חזרו לערך ההתחלתי 3 חודשים על מנה דלת חלבון, רמות BHBA הציגו עלייה מובהקת כעבור 3 חודשים. בקבוצת "ביקורת ההיריון" לא נמצאו הבדלים ברמות CREA (P = 0.74),

NEFA (P = 0.16), PUN (P = 0.40) ו BHBA (P = 0.33) עם התקדמות ההיריון.

 

טבלה 5: השפעת רמת החלבון במזון על רמות CREA, NEFA, PUN ו BHBA בפלסמה

∗ האותיות השונות מציינות הבדלים מובהקים בתוך השורות

1 חומצות שומן חופשיות

2 בטא הידרוקסי בוטיראט

 

רמת החלבון בשאריות ובצואה, בתגובה למנה דלת חלבון, רומזת כי תחת תנאי הזנה אלו הפרות נטו לנצל, ביעילות גדולה יותר, את החלבון מהמנה. ריכוזי PUN מצויים במתאם חיובי עם צריכת החלבון (Bunting et al., 1989). çì÷ î PUN æä îîåçæø ìëøñ åîñô÷ çð÷ï ìîé÷øåàåøâðéæîéí ùáúåøí îñô÷éí ìîòìé äâéøä çåîöåú àîéðå (Marini and Van Amburgh, 2003). àéð÷åøôåøöéä ùì PUN îîåçæø ìçìáåï çééã÷é ðîöà áéçñ äôåê ìøîú äöøéëä ùì äçìáåï (Bunting et al., 1989). áàåôï æä äðòëìåú ùì äîðä ãìú äçìáåï òùåéä ìäéåú îåùôòú ìçéåá åìäåøéã àú äðèì äàðøâúé. áðåñó, äòìééä ääãøâúéú áøéëåæ CREA áôìñîä òùåéä ìäöáéò òì úâåáä îèáåìéú ìöåøê áçð÷ï. CREA äåà äîåöø äñåôé ùì äîèáåìéæí ùì creatine בשריר, ומהווה אינדקס למסת השריר הכללית (Eisemann et al., 1989). בחזירים יצרנים בתחלובה עליה ברמות CREA בפלסמה נטו להתאים לעלייה ברמת ה PUN (Richert et al., 1996). המחברים הניחו כי זה עשוי לשקף עלייה בקטבוליזם של השריר כדי לעמוד בדרישה של ייצור החלב. במחקר הנוכחי מפתה להניח כי ריכוז CREA משקף úâåáä îèáåìéú ìãøéùú äçìáåï ùì äòåáø äîúôúç.

בתגובה לשלושה חודשים על מנה דלת חלבון, רמות הביטוי של Hsp70, Hsp90 ותת היחידה C2 של הפרוטאזום ברקמת השומן התת-עורי ירדו בהשוואה לרמתם בקבוצת הביקורת (איור 8A).

 

 


איור 8: השפעת מנה דלת חלבון על ביטוי חלבוני עקת חום, פרוטאזום ו A-FABP ברקמת השומן התת-עורי

הירידה בביטויים של חלבונים אלו בתגובה לעקת מזון אינה טיפוסית; המערכות ניסוייות רבות הגבלת קלוריות גרמה לעלייה בביטויים של חלבוני עקת חום (Duffy et al., 1997; Yu and Chung, 2001; Patel and Finch, 2002). äéøéãä ááéèåé Hsp ופרוטאזום במחקר הנוכחי יכולה להישקל בשתי רמות: א. ברמה המקומית של רקמת השומן התת-עורי – במקרה זה רקמת השומן המייצגת רקמה אוגרת אנרגיה שהתרחש בה תכנות מחדש של ביטוי גנים כהתאמה למצב המטבולי החדש. בשל היותם מעורבים בסינתזה ודגרדציה של חלבונים, מערכות ה Hsp70, Hsp90 והפרוטאזום מסייעות בתחלופה של חלבונים בתא, אשר במקרה של מנה דלת חלבון ירדה לרמת חדשה. כתמונת ראי לביטויים של הנ"ל, החלבון FABP עלה ברמת ביטויו בתגובה למנה דלת חלבון. בכך, תוצאה זו תומכת בתוצאות הביוכימיות המעידות על פרוק של שומנים.  ב. תגובה כללית – במקרה זה ההנחה היא כי תגובת ה Hsp ברקמת השומן משקפת גם את התגובה של הרקמות האחרות. במקרה זה, מנה דלת חלבון מכבידה על התגובה הכללית לעקה של הפרות עם השפעות שליליות אפשריות גם על ההפעלה של מערכת החיסון (Chen et al., 1999; Pockley, 2003).

ראוי לציין כי פרה מספר 2 לא שינתה את רמת הביטוי של החלבונים המוזכרים לעיל בתגובה לעקת חלבון ממושכת. ושוב, אינדיבידואלים כאלה צריכים להיות מושא למחקרים נוספים אם לוקחים בחשבון סלקציה לעמידות לריכוז חלבון נמוך במזון.

áùðé çì÷é äîç÷ø, æä äãï áò÷ú àðøâéä åæä äãï áò÷ú çìáåï ðîöàå ÷ååéí îùåúôéí áëì ä÷ùåø ìáéèåé ùì çìáåðé ò÷ú äçåí Hsp70 ו Hsp90 והחלבון FABP. בשניהם נמצא כי ביטוי חלבוני עקת החום יורד בעוד שביטוי FABP עולה. בנוסף, המחקרים נסבו סביב רקמות יוצרות או אוגרות אנרגיה.

לסיכום, הפרמטרים שנבחנו במחקר הנוכחי, על שני חלקיו, יכולים לשמש כאינדקס לזיהוי אינדיבידואלים בעדר נתון או כדי לבחון הבדלים בין גזעים לעמידות לעקות אנרגיה וחלבון.

 

רשימת ספרות:

Arieli, A., I. Bruckental, and E. Smoler. 1989. Prediction of duodenal nitrogen supply from degradation of organic and nitrogenous matter in situ. J. Dairy Sci. 72:2532-2539.

Arieli, A., S. Mabjeesh, H. Tagari, I. Bruckental, and S. Zamwell. 1993. Evaluation of protein flow to the duodenum in dairy cattle by the in sacco method. Livest. Prod. Sci. 35:283-292.

Association of Official Analytical Chemists 1990. Official Methods of Analysis, Ed.15, AOAC, Arlington, VA.

Boutinaud, M., Rulquin, H., Keisler, D. H., Djiane, J. and Jammes, H. 2002. Use of somatic cells from goat milk for dynamic studies of gene expression in the mammary gland. J. Anim. Sci. 80: 1258-1269.

Buehring, G. C. 1990. Culture of mammary epithelial cells from bovine milk. J. Dairy Sci. 73: 956-963.

 

Bunting, L. D., J. A. Boling, and C. T. MacKown. 1989. Effect of dietary protein level on nitrogen metabolism in the growing bovine: I. Nitrogen recycling and intestinal protein supply in calves. J. Anim. Sci. 67:810-819.

 

Chen, W., U. Syldath, K. Bellmann, V. Burkart, and H. Kolb. 1999. Human 60-kDa heat shock protein: a danger signal to the innate immune system. J. Immunol. 162:3212-3219.

 

German, T. and Barash, I. 2002. Characterization of an epithelial cell line from bovine mammary gland. In Vitro Cell. Dev. Biol. 38: 282-292.

 

Dahl, G. E. and Petitclerc, D. (2003). Management of photoperiod in the dairy herd for improved production and health. J. Anim. Sci. 3:11-17.

 

Dils, R. R. 1983. Milk fat synthesis. In: Biochemistry of Lactation. Mepham, T. B. ed. pp. 141-157. Elsevier, Amsterdam.

 

Duffy, P. H., Leakey, J. E. A., Pipkin, J. L., Turturro, A., and Hart R. W. 1997. The physiologic, neurologic, and behavioral effects of caloric restriction related to aging, disease, and environmental factors. Environ. Res. 73: 242-248.

 

Eisenmann, J. H., A. C. Hammond, T. S. Rumsey, and D. E. Bauman. 1989. Nitrogen and protein metabolism and metabolites in plasma and urine of beef steers treated with somatotropin. J. Anim. Sci. 67:105-115.

 

Jones, G. P. and Garnsworthy, P. C. 1989. The effects of dietary energy content on the response of dairy cows to body condition at calving. Anim. Prod. 49: 183-191.

 

Langley-Evans, S. C., M. Seakins, R. F. Grimble, and A. A. Jackson. 1994. The acute phase response of adult rats is altered by in utero exposure to maternal low protein diets. J. Nutr. 124:1588-1596.

 

Langley-Evans, S. C., G. J. Phillips, and A. A. Jackson. 1997. Fetal exposure to low protein maternal diet alters the susceptibility of young adult rats to sulfur dioxide-   induced lung injury. J. Nutr. 127:202-209.

 

Lalman, D. L., Williams, J. E., Hess, B. W., Thomas, M. G. and Keisler, D. H. 2000. Effect of dietary energy on milk production and metabolic hormones in thin, primiparous beef heifers. J. Anim. Sci. 78: 530-538.

 

Main, A. R. 1986. Resilience on the level of individual animal. In: Dell, B. Hopkins, A. J. M., Lamont, B. B. (Eds.), Resilience in Mediterranean Type Ecosystems. Dr W. Junk Publisher, Dordrecht, Netherlands, pp. 83-94.

 

Mallinckrodt, C. H., Bourdon, R. M., Golden, B. L., Schalles, R. R. and Odde, K. G. 1993. Relationship of maternal milk expected progeny differences to actual milk yield and calf weaning weight. J. Anim. Sci. 71: 355-362.

 

Marini, J. C., and M. E. Van Amburgh. 2003. Nitrogen metabolism and recycling in Holstein heifers. J. Anim. Sci. 81:545-552.

 

Meyer, K., Carrick, M. J. and Donnelly, B. J. P. 1994. Genetic Parameters for Milk Production of Australian Beef Cows and Weaning Weight of Their Calves. J. Anim. Sci. 72: 1155-1165.

 

NRC, 2001. Nutrient Requirements of Dairy Cattle. 7th Revised Edition. National Academy Press. Washington, DC, USA.

 

Patel, N. V. and Finch, C. E. 2002. The glucocorticoid paradox of caloric restriction in slowing brain aging. Neurobiology of Aging 23: 707–717.

 

Pockley, G. 2003. Heat shock proteins as regulators of the immune response. Lancet 362:469-476.

 

Richert, B. T., B. D. Tokach, R. D. Goodband, J. L. Nelssen, J. E. Pettigrew, R. D. Walker, and L. J. Johnston. 1996. Valine requirement of the high producing lactating sow. J. Anim. Sci. 74:1307-1313.

 

Shabtay, A. and Arad, Z. (2005). Ectothermy and endothermy: evolutionary     perspectives of thermoprotection by HSPs. J Exp Biol. 208: 2773-2781.

 

Simpson, M. A., LiCata, V. J., Ribarik Coe, N. and Bernlohr, D. A. 1999. Biochemical and biophysical analysis of the intracellular lipid binding proteins of adipocytes. Mol. Cell Biochem. 192: 33-40.

 

Siebert, B. D., and R. A. Hunter. 1982. Supplementary feeding of grazing animals. In: Proceedings of the International Symposium on Nutritional Limits to Animal Production from Pastures. Commonwealth Agricultural Science, Cambridge, pp. 409–426.

 

Sternberg, M., Gutman, M., Perevolotsky, A., Ungar, E. D. and Kigel, J. 2000. Vegetation response to grazing management in a Mediterranean herbaceous community: a functional group approach. J. Appl. Ecol. 37: 224-237.

 

Yahav S. and Hurwitz, S. (1996). Induction of thermotolerance in male broiler chickens by temperature conditioning at an early age. Poult. Sci. 75:402-406.

 

Yu, B. P. and Chung, H. Y. 2001. Stress Resistance by Caloric Restriction for Longevity Annal. NY Acad. Sci. 928(1): 39–47.

 

 

סיכום עם שאלות מנחות

 

1. מטרות המחקר תוך התייחסות לתוכנית העבודה.

א. לאפיין את התגובה של פרות בשר לעקות אנרגיה וחלבון ברמה הפיסיולוגית, הביוכימית והמולקולארית,

תוך בחינת המעורבות של חלבוני העקה בעקות הנ"ל.

ב. להרכיב אינדקס שיוכל לשמש לאיתור הבדלים בין גזעים ופרטים בתוך עדר עם עמידויות לרמות חלבון ואנרגיה נמוכות.

 

2. עיקרי הניסויים והתוצאות.

פרות בהריון ופרות בהריון ומניקות נבחנו במחקר זה לתגובות ברמה הפיסיולוגית, הביוכימית והמולקולארית לעקות הזנה, קרי עקת חלבון ואנרגיה. המשך המקסימאלי של הניסויים היה 3 חודשים. בניסוי עקת האנרגיה תעדנו שינויים בהרכב החלב (% השומן עלה עקב העקה), בפרופיל חומצות השומן (עלייה מובהקת בפרופורציה של חומצות שומן לא רוויות בחלב עקב העקה), ירידה בביטוי של חלבוני עקת חום ועליה בביטוי של FABP ו a-casein התאים הסומטיים בחלב. בניסוי עקת החלבון הייתה ירידה מיידית בקצב הלב עם הורדת ריכוז החלבון במנה, מאזן אנרגיה שלילי בחמש משש פרות הניסוי, שינוי בפרופיל הביוכימי של סמנים בדם למטבוליזם חלבון ושומן, ירידה בביטוי של חלבוני עקת חום ופרוטאזום ועליה בביטוי של FABP ברקמת השומן התת-עורי.

 

3. מסקנות מדעיות וההשלכות לגבי יישום המחקר והמשכו. האם הושגו מטרות המחקר לתקופת הדוח?

מהמחקר עולה כי ברקמות יצרניות או אוגרות אנרגיה, כמו רקמת העטין והשומן, ההתנהגות של חלבוני עקת החום היא דומה בתנאים של עקות הזנה. בהקשר זה ניתן לומר כי מטרות המחקר לתקופת הדוח הושגו. היישום העיקרי שיכול להתקבל מהמחקר הנוכחי, אך דורש מחקרים עוקבים, הוא שימוש באינדקס המוצע בדוח, והרחבתו, כדי להבין את השונות הקיימת בין גזעי פרות לעמידות לתנאי הזנה לקויים, ולאתר פרות בתוך עדר נתון שהן עמידות יותר לתנאים שנבחנו, כדי להשתמש בהן לסלקציה לכוונים הנ"ל.

 

4. בעיות שנותרו לפתרון ו/או שינויים (טכנולוגיים, שיווקיים ואחרים) שחלו במהלך העבודה; התייחסות  המשך המחקר לגביהן, האם יושגו מטרות המחקר בתקופה שנותרה לביצוע תוכנית המחקר?

בתכניות מחקר עוקבות יש לבצע חזרות על הניסויים עם מספר פרות גדול יותר. כמו כן צריך לחפש סמנים נוספים כדי להרחיב את האינדקס. צריך לפתח את היכולת ללמוד על המצב האנרגטי והמטבולי של הפרה באמצעות דיגום לא חודרני, קרי חלב, רוק או צואה.

 

5. הפצת הידע שנוצר בתקופת הדו"ח: פרסומים בכתב - ציטט ביבליוגרפי כמקובל בפרסום מאמר מדעי; פטנטים - יש לציין שם ומס' פטנט; הרצאות וימי עיון - יש לפרט מקום, תאריך, ציטוט ביבליוגרפי של התקציר כמקובל בפרסום מאמר מדעי.

הידע שנוצר במהלך שנת המחקר שמומנה נשלח לפרסום בעיתון Animal. חלק אחר של העבודה פורסם בעיתון Cell Stress & Chaperones וזכה לתמונת שער. חלק מהידע הוצג בכנסים מקומיים של בוקרים.

 

6. פרסום הדוח: אני ממליץ לפרסם את הדוח (סמן אחת מהאופציות)

רק בספריות 􀂽

ללא הגבלה (בספריות ובאינטרנט) 􀂽

חסוילא לפרסם 􀂽

 

האם בכוונתך להגיש תוכנית המשך בתום תקופת המחקר הנוכחי? כן- לא -

יש לענות על שאלה זו רק בדוח שנה ראשונה במחקר שאושר לשנתיים, או בדוח שנה שניה במחקר

 

 

Abstract

Selection for higher production rate in cattle inhabiting challenging habitats may be considered disadvantageous because of possible deleterious effects on immunity and reproduction, and consequently on calf crop percentage. In Israel, free grazing, high productive beef cows experience reduction in nutritional quality of forage during up to eight months of the year. Milk production by dams dictates calf performance, dam’s nutritional needs and rebreeding rates. Dietary protein is the first limiting component to the utilization of low-quality forage by ruminants. Low-protein diet (LPD) may cause metabolic disturbances to cows and their developing embryos. For this purpose we studied the effect of long-term caloric stress on milk characteristics and gene expression of stress and milk-components producing proteins as well as effect of long-term LPD on physiological, biochemical and molecular parameters of the energy status in gestating beef cows. We aimed at the developing of an Hsp-based index to pinpoint adaptive individuals within a herd and differences among breeds to low quality diet.

Lactating dams responded to caloric stress by decreased body weight, milk and milk protein production. To compensate for total energy loses in milk, they produced milk of higher fat concentration and shifted the proportions of its fatty acids towards long and unsaturated ones. This was reflected by increased mRNA transcription of the fatty acid binding protein. Prolonged low-energy diet promoted cell-specific Hsp response; whereas significant increase of Hsp90 but unchanged levels of Hsp70 proteins were observed in white blood cells, the expression of Hsp70 in milk somatic cells was markedly attenuated, in parallel with a marked increase of as1-casein expression. At the mammary gland level, these results may indicate a decrease in turn-over of proteins, and a shift to an exclusive expression of milk-components producing factors.

A LPD resulted in reductions in feed intake and heart rate and promoted a negative retained energy status after 3 weeks. Elevated levels of plasma creatinine and NEFA indicate endogenous degradation of fat and protein as a response to the demands for energy and nitrogen. Increasing levels of plasma b-Hydroxybutyrate confirmed the negative energy status obtained by the physiological measurements. Plasma urea nitrogen decreased after 3 weeks on LPD but returned to its initial concentration after 3 months of LPD. This pattern provides partial explanation for the unchanged body weight and body condition score in spite of the negative energy status. Whereas the levels of heat shock protein 90 (Hsp90), Hsp70 and proteasome subunits decreased after 3 months on LPD, adipocyte fatty acid binding protein (A-FABP) levels increased. At the level of the fat tissue these results may indicate a decrease in turn-over of proteins, at the cost of induced lipolysis.

Altogether, the physiological and molecular parameters can serve to test responses to LPD caloric stress and may provide an index to test suitability of beef cattle breeds to inadequate caloric demands.

לכל המבזקים....
office@milk.org.il פקס: 972-3-9564766 טל: 972-3-9564750 דרך החורש 4 , ת"ד 97, יהוד 5647003
מופעל באמצעות מעוף - מגוון אפקט