גנגליאוזידים ודלקות עטין

תוכנית מחקר: קוד זיהוי: 846-0293-06

O.Krifucks and G.Laitner

Department of microbiology, Kimron Veterinary Institute 


1. מבוא ורקע מדעי
גנגליאוזידים ((gangliosides הם מולקולות שומן המסונתזות ע"י כל החולייתנים. מולקולות אלו נמצאות בממברנות של כל התאים ובנוזלים ביולוגים כמו דם וחלב. הריכוז הגבוה ביותר של גנגליאוזידים מצוי ברקמה האפורה של המוח והיא מרכיבה את מעטפת העצבים. מקור הגנגליאוזידים בחלב הוא התאים האפתיליאלים של בלוטת העטין, המפרישים באופן אקטיבי מולקולות שומן אלה, תוך כדי הפרשת מרכיבי החלב וכן פירוק של התאים הסומאטיים בחלב.
מולקולות הגנגליאוזידים מורכבות מספינגוזין (sphingosine), רדיקאל של חומצת שומן ולפחות שתי שאריות פחמניות כגון: גלוקוז וגלאקטוז, וכן לרובם רדיקאלים של חומצה סיאלית (ניירומיניק) (ברובם מ-1 עד 4 שרשרות). הגנגליאוזידים מסווגים לפי מספר של שאריות החומצה הסיאלית: למונוסיאלוגנגליוזיד (GM), דיסיאלוגנגליוזיד (GD), טריסיאלוגנגליוזיד (GT) וקוואדרוסיאלו-גנגליוזיד ((GQ. בנוסף קיים גנגליוזיד, ה-asialo-GM1, החסר חומצה סיאלית (sialic acid).
מולקולות הגנגליאוזידים בתנאים חופשים, משוחררות מהתא לנוזלי הגוף כגון: דם, או בעיקר חלב ומשמשים:
א) קולטנים להורמונים וציטוקינים על מגוון רחב של תאים והשתתפותם חשובה בשלב גידול ודיפרנציאציה של תאים ורקמות al,1998 Furukawa K., et al, 1998, Takamiya K.), et;( Hakomori S., 1993
ב) קולטנים לנגיפים (נגיף ( Superti,F., et al,1991 ,Rota, חיידקים וטוקסינים ונטרולם כגון: הידבקות ראשונית לK99- E. coli,
(Lanne et al., 1995; De Bentzmann et al., 1996; Feldman et al., 1998)
Pseudomonas aeruginosa (Comolli, et al 1999) Campylobacter jejuni

(Sack, et al 1998) ופטריות כגון: Candida .(Lee, et al 1996 )
ידוע כי גנגליאוזיד GM1 משמש כקולטן ללייקוצידין של S. aureus, ( Noda, et al., 1980
,(Ozawa, et al., 1994: eat-labile enterotoxin של E. coli (1999 ;(Minke, et al (Laegreid, et al 1987) cholera toxin.
ידוע כי מונוסיאלוגנגליאוזידים (monosialogangliosides) בריכוזים פיזיולוגיים בדם (פחות מ 10-6 -g/l) יכולים לעכב התרבות תאים ופאגוציטוזה .in vitro גנגליאוזידים מסוג GD ו-GT, בריכוזים פיזיולוגיים, יכולים להגביר את תהליך הפאגוציטוזה והתרבות תאים (Yamaguchi et al., 1997), ובריכוזים גבוהים מעל 10-6 g/l כל הגנגליאוזידים בעלי יכולת עיכוב של פעולות תאי מערכת החיסון.
כמות הגנגליאוזידים בחלב תלויה בתזונה, בגזע, בעונת השנה וימים בתחלובה. התפלגות הגנגליאוזידים בחלב בופלו ופרות מגזע אדום (Swiss) ((100 mg/l: 60-70% GD3 ו-25-30% GM3. כמות הגנגליאוזידים בחלב משתנה לאורך התחלובה והריכוז הגבוה ביותר נמצא בקולוסטרום: 600-1500 מ"ג/ל. ב-24 השעות הראשונות לאחר ההמלטה כמותם יורדת לכשליש ותוך שבוע ל-200-100 מ"ג/ל. כמותם ממשיכה לרדת לכ-70-100 מ"ג/ל ועולה מחדש לקראת היובש. היחסים בין סוגי הגנגליאוזידים משתנה גם הוא לאורך התחלובה, כאשר חלה ירידה ב-GD3 ועליה ב-GM3. בנוסף עולים גנגליאוזידים אחרים כגון: ,GM1 GD1, GT1, GT3 , ו-GQ1, שנמצאים בכמויות אפסיות בקולוסטרום 1992; Pan X., Izumo T., 1999, 2000) Puente et al., Martin et al., 2001; Nakamura et al., 2003. et al. 2003, (Colarow
נכון להיום אין נתונים על כמות הגנגליאוזידים בחלב פרות מסוג Israeli Holsteinובנוסף על כך, לא קיימת שיטה לבדיקת גנגליואזידים באופן רוטיני ,המאפשרת לבדוק פרטנית כמות סטטיסטית של דוגמאות. השיטות הקיימות דורשות הכנת דוגמאות במשך זמן ממושך (24-96 שעות) ושימוש בציוד יקר כמו HPL TC ונוגדנים חד שיבטיים לכל סוגים של מולקולות הגנגליאוזידים.
בעבודה זו התמקדנו בדיקת GM1 עקב חשיבותו הרבה בתהליך התפתחות דלקת עטין, בתפקידו הייחודי בהדבקות לחיידקיים וקישור רעלנים גורמי דלקות עטין נפוצות כגון
, S. aureus, E. coli Pseudomonas aeroginosa.


 

2. מטרות המחקר
1. להתאים שיטתELISA מהירה לבדיקה כמותית של גנגליאוזידים מסוג 1GM קולוסטרום ולחלב באמצעות שימוש ברעלן הכולרה.
2. העמדת שיטה לקביעת 1GM הקשור לתאים בחלב ובחינת דוגמאות חלב מרבעי עטין נגועים בחיידקים כגון: E. coli או S. aureus.
3. לבחון האם קיים קשר בין רמת הגנגליאוזידים מסוג 1GM בקולוסטרום לבין סיכוי הדבקות תוך עטינית בחיידקים בחודש הראשון לאחר ההמלטה.


3. חשיבות המחקר
אפיון גנגליאוזידים, סוגים ורמתם, לאורך התחלובה בפרות מגזע Holstein-Israeli בתנאי המשק הקיימים יאפשרו לבחון האם קיים קשר בין רמתם וסיכויי הפרה לחלות במחלת עטין וכן משך ועוצמת המחלה. יתכן ונתונים אלו יהוו מערכת נתונים נוספת לאיתור וחיזוי פרות בעייתיות ו/או משקים במצב בעייתי בכל הקשור לדלקות העטין ויתכן גם לגידול השגר הניזון מהקולוסטרום.


4. שלבי העבודה
I). העמדת שיטות העבודה:
א) פיתוח שיטה לקביעת כמות יחסית של רמת 1GM בקולוסטרום וחלב באמצעות רעלן כולרה.
סולם רמות יחסיות של גנגליאוזיד מסוג 1GM בקולוסטרום ובחלב נקבע בשיטה דמוית ELISA על בסיס נטרול יחידה β של רעלן כולרה הידוע כקולטן טבעי לגנגליאוזיד 1GM.
ב) העמדת שיטה לקביעת 1GM הקשור לתאים.
ג). בחינת הקשר בין רמת הגנגלאיוזידים בקולוסטרום וסכויי הפרה לחלות במחלת עטין בחודשים הראשנים לאחר ההמלטה.


6. ניתוח סטטיסטי
ניתוח סטטיסטי של ניסוי שדה 1, ניתוח באמצעות χ2 של נטרול רעלן הכולרה (כולוסטרום מהול 1:10) בין פרות נקיות ונגועות.
ניתוח סטטיסטי מלא בוצע בניסוי שדה 2.
הניתוח בוצע באמצעות תוכנתJMP (SAS Institute, 2000). הניתוח כלל 108 פרות ומבכירות: 33 מבכירות ו-75 פרות מהמלטה שנייה ומעלה. כל פרה הוגדרה כנקייה מנגיעות חיידקים או נגועה בחיידקים בלפחות רבע עטין אחד. נטרול רעלן הכולרה בוצע במהול של 1:10 ו-1:40.
הניתוח בוצע במודל: two-way ANOVA model in a random design כאשר האפקט שנבחן היה פרה נקייה או נגועה ונבחן עבור מבכירות ופרות מהמלטה שנייה ומעלה, בנפרד.

 

המודל הסטטיסטי:


Yij = μ + αi + βj + αβij + eijk
μ = Mean of all data.
αi = The difference between the mean of Udder Infection i from the trial mean.
βj = The difference between the mean of Lactation j from the trial mean.
αβij = interaction between Udder Infection and Lactation.
(eijk = Residual variance between measurements (Random Error.

 


תוצאות: 1. העמדת שיטות:
א) פיתוח שיטה לקביעת כמות יחסית של רמת 1GM בקולוסטרום וחלב באמצעות רעלן כולרה. השיטה לקביעת רמת הגנגליאוזידים 1GM התבססה על יכולתה של שרשרת רצפטורית של היחידה β של רעלן הכולרה (cholera toxin – (β להתקשר למולקולה GM1 עם ספציפיות הדומה לנוגדן חד-שבטי ( Gascoyne, N., Van Heyningen, W.E., 1975.) במהלך העמדת השיטה, נבדקו ריכוזים שונים של GM1 לציפוי פלטות: מ-100 µg/ ml עד ng/ml 10, בופרים שונים ופלטות 96 בארות מסוגים שונים כגון: "MaxiSorb", "PolySorb" ,"”MediumSorb. נמצא כי ריכוז של ng/ml100 בפלטות מסוגpolysorb" " של NUNC מתאימים לביצוע הבדיקה.
סדר עבדה של שיטת דמוי האליזה תחרותית: פלטות מסוג "PolySorb" של 96 בארות ל ELISA-מצופה עם גנגליאוזיד מסוג GM1, (100 µl/באר), בריכוז של ng/ml100 בבופר פוספט ((PBS pH-7.2 הדגרו למשך הלילה בטמפרטורה של 25~ מ"צ. שטיפת (3(x בבופר פוספט עם 0.05% Tween-20 ( (PBST(5 דקות בטמפרטורת החדר). לאחר השטיפה בוצעה חסימה עם תמיסה PBS עם0.5% אלבומין של בקר (BSA) למשך שעה בטמפרטורה של 37 מ"צ. לאחר השטיפה, הוכנס לכל באר (µl100/ באר), קולוסטרום או חלב לאחר הדגרה עם CT- βמסומן עם HRP (פראוקסידאז). מהולים: קולוסטרום: 01:1 ו-1:40 וחלב 1:1 ו-1:10. בדיקה בשני מהולים ושלוש חזרות לכל מהול נבעה מיכולת היחידה β של רעלן הכולרה לקשור עד 5 מולקולות GM1 וכתוצאה מכך מהול גבוה מדי או נמוך מדי עשויים לתת הבדלים גדולים בקריאה. במקביל, לכל פלטה הוסף רעלן הכולרה כסטנדרט פנימי. לאחר הדגרה של שעה בטמפרטורת החדר ושטיפה, הוסף לבארות סובסטרט (substrate) ABTS לפיתוח צבע. עוצמת הצבע נקראה במכשיר קורא אליזה באורך גל של 405 נ"מ. תוצאות אחוז הנטרול של מולקולת GM1 עבור כל קולוסטרום או חלב הושוו עם הסטנדרט מחושב כ-100% קשירה. שימוש בסדר עבודה זה אפשר לקבל חזרתיות טובה. העמדת השיטה התבססה על ידע ספרותי (, R.,M. 2005 (Dawson והותאמה לרגישות עבודה עם CT-β מסומן עם HRP.
ב) העמדת שיטה לקביעת 1GM הקשור לתאים.
הותאמה שיטת קשירה של רעלן הכולרה לגנגלאוזידים ממברנאלים על גבי לויקוציטים (תאים לבנים) וקריאה במכשיר .FACS השיטה מבוססת על צבעית לימפוציטים עם CT- βמסומן עם חומר זרחני (.(FITC Thomas, וחובריו (2004), מצאו כי גנגליאוזיד אנדוגני(endogenic) GM1, כמעט ואינו מופיע בממברנות הלימפוציטים (מסוג B או (Tבדם ובנוסף לא קיים מידע על ביטוי של גנגליאוזיד זה בלימפוציטים מהחלב.


תוצאות ודיון: 2.
על בסיס השיטה לקשור 1GM לתאים, נבדק ביטוי של GM1 בלימפוציטים מחלב במצב בריא (ללא נגיעות תוך עטינית בחיידק) ובמצבי דלקת כתוצאה מנגיעות תוך עטינית בסטרפטוקוקוס דיסגלאקטיא.
איור 1 ואיור 2 מציגים דוגמא לתוצאות, שהתקבלו בחלב ללא נגיעות, בחלב מרבע נגוע בסטרפטוקוקוס דיסגלאקטיא וכן בדם (ביקורת). דוגמאות החלב נלקחו מאותה הפרה, הידועה כנגועה בחיידק זמן ארוך וזאת על מנת להקטין את השונות הקיימת בין פרות. ניתוח הנתונים מראה כי בלימפוציטים מהדם, בדומה לעבודתו של (Thomas, 2004), GM1 לא בא לידי ביטוי. בחלב מרבעים ללא נגיעות, ביטוי של GM1 נמצא גבוה על גבי לימפוציטים מסוג T, הן המציגים קולטן ל- CD4 או CD8. אחוז הלימפוציטים החיוביים (מציגי הגנגלאוזיד) נמצא גבוה יותר בלימפוציטים מסוג CD8 (90-70 אחוז) מאשר CD4 (50~ אחוז). לעומת זאת, בחלב ממקור נגוע בחיידק, אחוז הלימפוציטים משני הסוגים B ו-T עם GM1ממברנלי נמצא נמוך ביותר. תוצאות דומות קבלנו גם במבחן ביטוי GM1 על גבי נאוטרופילים מחלב ללא נגיעות וחלב מרבע במצב דלקתי: נאוטרופילים בחלב מרבע ללא נגיעות בקטריאלית מציגים הרבה יותר GM1 מאשר נאוטרופילים מרבע דלקתי (איור 2).
לימפוציטים מסוג T הם מרכיב עיקרי במערכת החיסון הייחודית, כאשר לימפוציטים נושאי קולטן ל-CD4 משמשים כמכווני התגובה החיסונית ואלו הנושאים קולטן CD8 מופקדים על פעילות הרג של תאים נגועים בחיידקים ו/או נגיפים. שימוש בצביעה כפולה עם נוגדנים נגדCD45RO מאפשר לאבחן האם הלימפוציטים משופעלים (מאוקטבים) או נאיביים. מתוצאות ראשוניות אלו עולה כי לימפוציטים בחלב בריא עוברים תהליך של שפעול, המעלה את יכולת פעילותם ובמקביל מציגם כמולקולות של GM1. בחלב מבלוטות נגועות בחיידק אחוז הלימפוציטים המשופעלים גבוה יותר, אך בו בזמן אינם מציגים או מציגים באופן נמוך קולטן זה. תוצאה היכולה לנבוע מסביבה עוינת לתאים ו/או מכניסה מסיבית של לתאים מזרם הדם. בכל מקרה, תוצאות אלו מראות כי יכולת הפעילות של הלימפוציטים בבלוטות נגועות בסטרפטוקוקוס דיסגלאקטיא נמוכה מזו אשר בחלב בריא.
ג). בחינת הקשר בין רמת הגנגליאוזידים בקולוסטרום וסיכויי הפרה לחלות במחלת עטין בחודש הראשון לאחר ההמלטה. בוצעו שני ניסויי שדה: 1. כלל 38 פרות ומבכירות 2. 33 מבכירות ו-74 פרות, שני הניסויים נערכו ברפת מכון וולקני.
1. דגימות הקולוסטרום הראשוני מ-38 פרות ומבכירות נאספו בחליבה ראשונה והוכנסו להקפאה. חלב על בסיס רבע נלקח 10~ ו-30~ ימים לאחר ההמלטה ונבחן לנוכחות בקטריאלית ותאים סומאטיים. רמות יחסיות של גנגליאוזיד מסוג 1GM בקולוסטרום נקבע באמצעות ניטרול רעלן כולרה ב-ELISA לאחר איסוף כל דוגמאות הקולוסטרום. רבע עטין נקבע כנגוע בחיידק אם אובחן חיידק בחלב מלווה בעליה בתאים סומאטיים. בכל הפרות עם נגיעות בקטריאלית, אותו חיידק אובחן בשתי הבדיקות, כאשר רוב החיידקים שאובחנו נמצאו שיכים לקבוצת ה-CNS ומקצתם סטרפטוקוקוס דיסגלקטיא.
ניתוח התוצאות הראה כי קיים קשר בין רמת הגנגלאוזיד בקולוסטרום וסיכויי הפרה להדבק באחד מהחיידקים שאובחנו. רמת הגנגליאוזיד מסוג 1GM בקולוסטרום של הפרות שנדבקו בלפחות אחד מרבעי העטין בחודש הראשון לתחלובה, נמצא נמוך על גבול המובהקות (איור 3).
2. דגימות הקולוסטרום הראשוני מ-33 מבכירות ו-75 פרות מהמלטה שנייה ומעלה נאסף בחליבה ראשונה והוכנס להקפאה. מצב העטין נבחן באותה המתכונת של ניסוי שדה 1. ניתוח התוצאות הראה על הבדל בין מבכירות ופרות. במבכירות לא נמצא הבדל בין בריאות ונגיעות ברמת אחוז הנטרול של מולקולת ובפרות כן נמצא הבדל (איור 4). קולוסטרומים של פרות בתחלובה שנייה ומעלה, שהיו בריאות ולא נדבקו תוך עטינית בחודש הראשון לאחר ההמלטה, נמצאו עם רמות 1GM גבוהות באופן מובהק (P = 0.0091) מהפרות שנדבקו תוך עטינית (איור 4, טבלה 1). עוצמת נטרול רעלן הכולרה (1:40) בקבוצת המבכירות לא היה שונה מובהק בין הבריאות והנגועות ועמד על 40%~. לעומת זאת בקבוצת הפרות, ממוצע הניטרול בפרות הבריאות עמד 35%~ בעוד שבקבוצת הפרות הנגועות על 19.7% בלבד.
תוצאות שני ניסויי השדה מצביעים על כך כי קיים מתאם בין רמת הגנגלאוזידים מסוג 1GM בקולוסטרום וסיכויי הפרה לחלות במחלות עטין. רמות נמוכות קשורות כנראה לפגיעה במצב הבריאותי של הפרה בהכנתה לקראת ההמלטה ובכך מגדילה את סיכוייה לחלות במחלות שונות לרבות מחלות עטין. חשוב לציין כי גורמי דלקת העטין בניסוי זה היו מגוונות, הן חיידקים גרם שליליים (קוליפורמים) והן גרם חיוביים (סטרפטוקוקים וסטפילוקוקים קאגולזה שלילת -CNS). לא ברור ההבדל בין מבכירות ופרות מהמלטה שנייה, אך יתכן כי הוא נובע ממועד ההדבקה. על פי סוג החיידקים במבכירות, יתכן וההדבקות התוך עטיניות חלו הרבה לפני ההמלטה ולכן לא נמצא קשר בין רמת הגנגליוזיד ומצב בריאות הפרה. מצב זה שונה בפרות. רוב הפרות היו נקיות בהיכנסן לתקופת היובש ובנוסף טופלו בתכשיר אנטיביוטי. לכן, רוב ההדבקות חלו במהלך תקופת היובש CNS)) או בתחלובה מחיידקים קוליפורמים.
לעבודה זו חשיבות רבה בהבנת הפעילות החיסונית המולדת וחלקם של מרכיבים כגון מולקולות אלה במתן הגנה בפני פתוגנים. מולקולות אלה הנמצאות בממברנות של התאים ובנוזלים ביולוגים כמו דם וחלב מהווים נדבך נוסף בהגנה וזיהוים, והבנת תפקידם במתן הגנה בפני גורמי תחלואה בכלל ובעטין בפרט יאפשר התמודדות טובה יותר בעתיד .

 


ביבליוגרפיה

De Bentzmann, S., Roger, P., Dupuit, F., Bajolet-Laudinat, O., Fuchey, C., Plotkowski , M.C., Puchelle, E., 1996. Asialo GM1 is a receptor for Pseudomonas aeruginosa adherence to regenerating respiratory epithelial cells. Infect. Immun., 64:1582-1588.
Colarow, L., Turini, M., Tenenberg, S., Berger, A., 2003. Characterization and biological activity of gangliosides in buffalo milk. Biochem. Biophys. Acta, 1631:94-106.
Comolli, J., C., Waite, L.L., Mostov, K.E., Engel, J.N., 1999. Pili binding to asialo-GM1 on epithelial cells can mediate cytotoxicity or bacterial internalization by Pseudomonas aeroginosa. Infec. Immun., 67:3207-3214.
Dawson, R.,M. (2005). Characterization of the binding of cholera toxin to ganglioside GM1 immobilized onto microtitre plates., J. Appl. Toxicol., 25:30-38.
Feldman, M., Bryan, R., Rajan, S., Scheffler, L., Brunnert, S., Tang, H., Prince, J., 1998. Role flagella in pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa pulmonary infection. Infect. Immun., 66:43-51.
Gascoyne, N., Van Heyningen, W.E., 1975. Binding of cholera toxin by various tissues. Infect. Immun., 12:466-469.
Hakomori, S., 1993. Structure and function of sphingoglycolipids in transmembrane signaling and cell-cell interactions. Biochem. Soc. Trans., 21:583-595.
Laegreid, A., Kolsto Otnaess, A.B., 1987. Trace amounts of ganglioside GM1 in human milk inhibit enterotoxins from Vibrio cholerae and Escherichia coli. Life Sci. ,40:55-62.
Lanne, B., Uggla, L., Stenhagen, G., Karlsson, K.A., 1995. Enhanced binding of enterotoxigenic Escherichia coli K99 to amide derivates of the receptor ganglioside NeuGs-GM3., Biochemistry, 34:1845-1850.
Lee, K.K., Yu, L., Macdonald, D.L., Paranchych ,W., Hoges, R.S., Irvin, R.T., 1996. Anti-adhesin antibodies that recognize a receptor-binding motif (adhesintope) inhibit pilus/fimbrial-mediated adherence of Psudomonas aeroginosa and Candida albicance to asialo-GM1 receptors and human buccal epithelial cell surface receptors., Can. J. Microbiol., 42:479-486.
Martin M.-J., Martin-Sosa S., Garcia L.-A., Hueso, P., 2001. Distribution of bovine milk Sialoglycoconjugates during lactation. J. Dairy Sci., 84:995-1000.
Minke, W.E., Roach, C., Hol, W.G., Verlinde, C.L., 1999. Structure-based exploration of the ganglioside GM1 binding sit for Escherichia coli heat-labile enterotoxin and cholera toxin for the discovery of receptor antagonist. Biochemistry, 38:5684-5692.
Nakamura, T., Kawase, H., Kimara, K., Watanabe, Y., Ohtani, M., 2003. Concentrations of sialyloligosaccharides in bovine colostrums and milk during the prepartum and early lactation. J. Dairy Sci., 86:1315-1320.
Noda, M., Kato, I., Hirayama, T., Matsuda, F., 1980. Fixation and inactivation of staphylococcal leucocidin by phosphatidylcholine and ganglioside GM1 in rabbit
Polymorphonuclear leukocytes. Infect. Immun., 29:678-684.
Ozawa, T., Kaneko, J., Narya, H., Izaki, K., Kamio, Y., 1994. Inactivation of gamma-hemolisin H gamma II component by addition of monosialoganglioside GM1 to human erythrocytes., Biosci. Biotechnol. Biocchem., 58:602-605.
Pan, X.L., Izumo, T., 1999. Chronological changes in the ganglioside composition of human milk during lactation., Early Human Develop., 55:1-8.
Pan, X.L., Izumi, T., 2000. Variation of the ganglioside compositions of human milk, cow`s milk and infant formulas. Early Human Develop., 57:25-31.
Puente, R., Garcia-Pardo, L.-A., Hueso, P., 1992. Gangliosides in bovine milk. Changes in content and distribution individual ganglioside levels during lactation.
Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 373: 283-288.
Sack, D.A., Lastovica, A.J., Chang, S.H., Pazzaglia, G., 1998. Microtiter assay for detecting Campilobacter spp. and Heliobacter pylori with surface gangliosides which bind cholera toxin. J. Clin. Microbiol., 36:2043-2045.
Superti, F., Donelli, G., 1991. Gangliosides as binding sites in SA-11 rotavirus infection of LLC-MK2 cells. J. Gen. Virol., 72:2467-2474.
Takamiya, K., Yamamoto, A., Furukawa, K., Zhao, J., Fukumoto, S., Yamashiro, S., Okada, M., Haraguchi, M., Shin, M., Kishikawa, M., Shiku, H., Aizawa, S.,
Furukawa, K., 1998. Complex gangliosides are essential in spermatogenesis of mice. Possible roles in the transport of testosterone. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:12147-12152.
Thomas, S., Preda-Pais, A., Casares, S., Brumeanu, T.D., 2004. Analysis of lipid rafts in T cells. Mol. Immunol., 41:399-409.
Yamaguchi, S., Miyazaki, Y., Oka, S., Yano, I., 1997. Stimulatory effect of gangliosides on phagocytosis, phagosome-lysosome fusion, and intracellular signal transduction system by human polymorphonuclear leukocytes. Glycoconjugate J., 14:707-714.

 

 

טבלה 1. ממוצעי אחוז הנטרול של מולקולת GM1 בקולוסטרום על פי חלוקה להמלטה (ראשונה או שנייה ומעלה) ועל פי מצב העטין (בריא או נגוע) וערכי המובהקויות (P value) בכל עמודה ושורה.


 

 

 

 

 

 

 

 

 

איור 1. ביטוי גנגליאוזיד מסוג 1GM על ממברנות של לימפוציטים מדם וחלב.(צבעיה כפולה) המספר מציין את אחוז התאים נושאי הקולטן.
ציר –X סימון תאים עם רעלן כולרה FITC,
ציר-Y סימון תאים עם נוגדנים כנגד מקולטנים שונים על תאי מערכת החיסון.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

איור 2. ביטוי גנגלאוזידים מסוג 1GM על ממברנות נאוטרופילים מחלב נקי ונגוע .
המספר מציין את אחוז התאים נושאי הקולטן
ציר –X סימון תאים- נאוטרופילים להם נקשר רעלן כולרה צבוע ב FITC
ציר-Y מספר תאים

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

איור 3.התפלגות של רמת גנגלאוזידים מסוג 1GM בקולוסטרום של פרות ומבכירות לפי מצב העטין בחודש הראשון לתחלובה: נגוע בחיידקים (14 פרות) או בריא ללא ממצא חיידקי (24 פרות). הבדל בין הקבוצות נמצא על גבול המובהקות.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

איור 4. רמת גנגלאוזידים מסוג 1GM בקולוסטרום של מבכירות ופרות מתחלובה שניה ומעלה, לפי מצב העטין בחודש הראשון לתחלובה ועוצמת האפקט (P value)
NBF= ללא ממצא חיידקי – רבע נקי

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

הערות
1. כל ההצעות לתיקון במבוא תוקנו
2. במחקר זה הייה צורך לעמיד שיטה שתאפשר את ביצועו ולכן העמדת השיטה הוכנסה כמטרה ראשונה. יתרה מזאת, ללא העמדת השיטה, המחקר לא היה מתבצע והכסף לשנה שיניה ושלישית היה מוחזר לגורם המממן.
3. סעיף "תוכנית המחקר" הוצא מהדוח.
4. התוצאות עוסקות בפיתוח השיטות כחלק מובנה ממטרות המחקר. לאור הערות הבוחנים שונה קטע זה וחולק לשנים 1. העמדת השיטות 2. תוצאות המחקר ודיון.
5. בטבלאות ובגרפים הוספו הסברים לציר הX וציר ה Y

לכל המבזקים....
office@milk.org.il פקס: 972-3-9564766 טל: 972-3-9564750 דרך החורש 4 , ת"ד 97, יהוד 5647003
מופעל באמצעות מעוף - מגוון אפקט