מחקר מספר 819-0050-06

 

דוח מסכם לתקופה 2004 - 2006

 

מציאת גורם פתוגני משותף לחיידקי Escherichia coli הגורמים דלקת עטין בפרות

 

דן הלר המחלקה למדעי בעלי חיים, הפקולטה למדעי החקלאות המזון ואיכות הסביבה.

גבריאל לייטנר, המחלקה למחלות עטין, המכון הווטרינרי ע"ש קימרון.

שלמה בלום, החטיבה לבקטריולוגיה, המכון הווטרינרי ע"ש קימרון.

 

 

תקציר
בעבר נעשו ניסיונות לאפיין את החיידק Eschericia coli (א. קולי) ממקרי דלקת עטין באופן סרולוגי, אך לא נמצא כל גורם משותף בין הבידודים השונים. לאור שכיחותם הגבוהה של א. קולי כגורם העיקרי לדלקות עטין קליניות ברפת החלב העולמית הגורמת להפסדים גבוהים, וההכרה כי קיימת התמחות והתפצלות של רוב גורמי מחלה, לרבות מחלות הנגרמות ע"י משפחת חיידקים זו, בוצע מחקר זה. מטרת המחקר היה בחון לבחון האם קיימות תכונות ייחודיות המאפשרות לתת אוכלוסייה של חיידקי א. קולי להתמחות לסביבת העטין: לחדור מבעד לתעלת מבוא הפיטמה, להתרבות באופן יעיל ע"י ניצול יעיל של חומרי המצע ולהתחמק באופן יעיל מפעילות המערכת החיסונית בעטין. אפיון תכונות ייחודיות לקבוצת חיידקי א. קולי, בעלת התמחות לעטין, תאפשר הבנה טובה יותר של גורם המחלה, איבחון מדויק יותר ותאפשר טיפול מתאים יותר. המחקר נבנה כמודל והתמקד ברפת אחת. בודדו 11 בידודי חיידק א. קולי מדלקות עטין קליניות בתקופה של כחודש ימים ובקביל 11 בידודים נוספים מסביבת הפרה. כל הבידודים הוגדרו שאכן הם א. קולי בשיטות איבחון בקטריולוגית, כימיות וסרולוגית, בוצע מבחן רגישות לחומרים אנטימיקרוביאליים ובוצע ניתוח לתכונות אלו. נמצאה שונות גדולה בין כלל הבידודים והתכונות, אך בו בזמן לא נמצא קשר בין תכונה למקור בידוד החיידק.
תכונות פיסיולוגיות של החיידקים נבחנו במעבדה: 1. קצב גדילת החיידק בחלב מלא ובמקביל במצע תרבית, 2. פרמנטציה של לקטוז, 3. רגישות לנסיוב, 4. קצב הצמדות, בליעת החיידק והרג ע"י נואוטרופילים בשני מבחנים בלתי תלויים. בנוסף בוצע הרצת DNA בשיטת פלס-פילד אלקטרופורזה (Pulse-field gel electrophoresis) ותבנית המקטעים נותחה באמצעות אנליזה מקבצית (Closter analysis). בקבוצת מבחנים זו נמצאה שונות בין שתי קבוצות החיידקים (עטין וסביבה). בידודי א. קולי מהעטין התחלקו בקצב משמעותי מהיר יותר בחלב מאשר בידודי הסביבה, ומספר החיידקים בשלב הסטציונרי גבוה משמעותי . הבדלים אלו לא נמצאו כאשר החיידקים גודלו במצע העשיר. הבדל נמצא ביעלות פרמנטציה של לקטוז, כאשר הווה את מקור הפחמן היחיד במצע, בידודי העטין ניצלו את הלקטוז באופן משמעותי יעיל יותר מאשר בידודי הסביבה. מבחנים אלו מצביעים בבירור על התמחות של הבידודים אשר בודדו מדלקות העטין: התחלקות בקצב מהיר בחלב ע" ניצול יעיל של סוכר החלב. בידודי הסביבה נמצאו בעלי פוטנציל גדילה דומה במצע העשיר, משמע אי פגיעה בתכונה זו במצע המכיל מקורות פחמניים שונים אך בו בזמן, מחזק את תכונת התמחות בידודי העטין. הבדל משמעותי ((P< 0.001 נמצא בין מקור בידוד החיידק ורגישות לנסיוב, כל בידודי א. קולי מהעטין נמצאו רגישים לנסיוב לעומת 8/11 בידודי הסביבה שנמצאו עמידים. תוצאה מפתיעה זו מציעה כי פעילות עיכוב והרג מרכיבי הנסיוב אינם נמצאים או נמצאים בכמויות נמוכות יותר בחלב ולכן חיידקים בעלי התמחות לעטין אינם זקוקים לתכונה זו. יתרה מזאת, יתכן וממצא זה מסביר מדוע אחוז הפרות עם דלקות עטין קלינית אינן בקטירימיות (ללא ממצא של חיידקים בדמן). נמצאו הבדלים משמעותיים בין קבוצות החיידקים בקצב היצמדותם, בליעתם והרגתם ע"י תאים נואוטרופילם, בידודי א. קולי מהעטין נצמדו לאט יותר ((P< 0.001, נבלעו פחות ((P< 0.001 וקצב הרג נמוך יותר אך לא מובהק.. תוצאות אלו מצביעות בברור על התמחות לתכונות התחמקות/התגוננות בפני המערכת התאית החיסונית בעטין. ניתוח תבנית ה DNA הראתה על שתי קבוצות נבדלות גנטית עם אחוזי זהות של 79% בתוך כל קבוצה. לסיכום, בעבודה זו כמו ברבות אחרות לא נמצאו הבדלים בתכונות פנוטיפיות אך כן נמצאו, בפעם הראשונה בעוצמה שכזו, הבדלים בתכונות פיסולוגיות של החיידק ואינטרקציה עם המערכת החיסונית של הפרה בעטין, תכונות המצביעות בברור על התמחות ויצרת תת אוכלוסייה הגורמת לדלקות עטין בעלת מאפיינים גנטיים.


מבוא
למרות המאמץ הרב המושקע בהתמודדות ממשקית ומחקרית עם דלקות העטין הנגרמות בגין חיידק אשריכיה קולי Eschericia coli)) (א. קולי), החיידק ממשיך להוות אחד מגורמי מחלות העטין העיקרים ברפת החלב המוביל להפסדים כבדים.
(Oliver and Mitchell, 1984; Smith et al., 1985 a;b; Oliver, 1988; Todhunter et al., 1995; Bradley, 2002; Hogan & Smith, 2003; Hillerton & Berry, 2003).
בסקרים ועבודות אפידמולוגיות שנערכו בארצות שונות נמצא כי א. קולי מבודד ממרבית דלקות עטין הקליניות לדוגמה: באנגליה (Bradley & Green, 2000) , בצרפת (Longo et al., 2001), ובישראל בניתוח גורמי דלקת העטין בשנים 1989-1993 נמצא א. קולי 50% < כגורם הדלקת
(Shpigel et al., 1998). נתונים אלו משקפים את המציאות גם היום ואף לחומרה.
חיידקי א. קולי, מעורבים במגוון רחב של מחלות ובעלי חיים שונים. על בסיס תכונות פתוגניות שונות של החיידק, בעל החיים וסוג המחלה, סווג החיידק לקבוצות כגון:

I. Enteric infections
1. entero-hemorrhagic E. coli (EHEC)
2. entero-pathogenic E. coli (EPEC)
3. entero-toxigenic E. coli (ETEC)
II. Extra-intestinal infections (ExPEC)
4. avian pathogenic E. coli (APEC), which causes air sacculitis, cellulitis and septicemia in poultry (Rodriguez-Siek et al., 2005)
5. uro-pathogenic E. coli (UPEC), which causes urinary infections in dogs (Gyles, 1994; Donnenberg, 2002).

לפי סווג זה, נמצאים מספר מצומצם של מיני החיידק בכל תת קבוצה, עם מכנה משותף, משמע התמחות. יחד-עם-זאת, לא נמצא מכנה משותף לחיידקי הא. קולי המבודדים מדלקות העטין ועל כן הדעה הרווחת היינה כי אין העדפה לחיידקים הנמצאים בסביבת הפרה, וכל הזדמנות לחדירה לעטין תנוצל ע"י כל חיידק לחדירה לפתח הפיטמה לגרימת דלקת.
(Saran-Rosenzuaig et al., 1972; Sanchez-Carlo et al., 1984; Nemeth et al., 1991; Lehtolainen et al., 2003; Nemeth et al., 1994; Lipman et al., 1995b; Correa & Marin, 2002; Kaipanen et al., 2002; Bean et al., 2004; Wenz et al., 2006).
תוצאות אלו, של בידודים רבים ללא מכנה משותף מתבטאות גם בניסיונות האפיון הגנטי, כאשרהחוקרים מצאו זנים שונים בין משקים שונים ובתוך אותו משק
(Lipman et al., 1995a; Wenz et al., 2006), וכן לא נמצא קשר לעוצמת המחלה

(Wenz et al., 2006). בשונה מעבודות אלו נמצא בעבודת מחקר של Bradley וחובריו, (2001), כי מספר הגנוטיפים שנמצאו מדלקות עטין קטן מזה שבסביבה.
לאור תוצאות אלו, הגיעו החוקרים למסקנה כי א. קולי הגורם לדלקת העטין, היינו אקראי, מנצל הזדמנות לחדירה, ועוצמת המחלה תלויה בפרה ולא בחיידקBurvenich et al., 2003) ).
מנגנון חדירת החיידק לעטין אינו ברור למרות שישנה הסכמה בין החוקרים כי מירב דלקות העטין נגרמות לאחר חדירת החיידק דרך תעלת מבוא הפיטמה. איבר זה בנוי ממערת מורכבת של שרירים סוגרים, התעלה מצופה קרטין וחומרים מסיסים בחלב כגון לקטופרין, שהם בעלי פעילות אנטיבקטריאלית המונעים חדירה של חיידקים לעטין
(Sordillo et al., 1997, Hogan & Smith, 2003, Rainard & Riollet, 2006) . לאחר חדירתו של החיידק לעטין, חייב החיידק לנצל את חומרי המזון בעטין, להתחלק וכתוצאה מכך לגרום לתגובה המאכסן הדלקתית. מחקרים הראו כי מספיק להחדיר דרך תעלת מבוא הפיטמה 30-50 חיידקים על מנת לקבל 100% דלקות עטין (Kornalijnslijper et al., 2004). יחד עם זאת, התגובה הדלקתית מתקבלת רק לאחר שהחיידקים מתחלקים ומגיעים למספר רב (Rainard & Riollet, 2006). Kornalijnslijper וחובריו (2004) מצאו קשר משמעותי בין עוצמת התגובה הדלקתית ומספר החיידקים בחלב לאחר שש שעות מהדבקה מלאכותית וכן נמצא כי הדבקה במספר רב יותר של חיידקים מוביל לתגובה דלקתית מהירה יותר ((Vangroenweghe et al., 2004. תוצאות אלו מצביעות בברור כי לקצב חלוקת החיידק בעטין, תפקיד עיקרי בתגובה הדלקתית הקלינית שאינה נופלת מתהליך החדירה עצמו ( Hogan & Smith, 2003; Burvenich et al., 2003)).
המפתח המולקולרי לתגובה הדלקתית לחיידקים גרם-שליליים, לרבות א. קולי, הוא פוליסכריד ממברנאלי - outer membrane lipopolysaccharide (LPS), הנוצר בזמן חלוקת החיידק ומשוחרר לסביבה בזמן התפרקות החיידק. LPS הוא הגורם המגרה לתגובה הדלקתית בעטין ותגובות רבות אחרות, סיסטמיות בפרה (Hogan & Smith, 2003; Burvenich et al., 2003).
הישרדות החיידק בעטין תלויה גם ביכולת ההתמודדות כנגד מרכיבים האנטיבקטריאליים ומרכיבי מערכת החיסון, בעיקר המרכיב התאי הבלתי ייחודי. פעילות המערכת התאית תוארה
בהרחבה בעבודות קודמות :(Sordillo et al., 1997; Burvenich et al. 2003; Burton & Erskine, 2003; Rainard & Riollet, 2006).
הפעילות העיקרית בסילוק החיידק מבוצעת ע"י נדידה של תאי מערכת החיסון ממערכת צינורות הדם לעטין הנגוע ובליעה והרג של החיידקים ע"י נאוטרופילים ומונוציטים. גיוס תאים אלה מתחיל כ 3 שעות לאחר חדירת החיידק וזאת כתוצאה מגירוי LPS ושרשת תגובות של תאי מערכת החיסון ותאי האפיתל בעטין בהפרשת ציטוקינים כימוטקטיים (TNF, 1-IL, 8-IL), ופתיחת המעבר הבין תאי באנדוטל. פעילות יעלה של התאים הבלענים תלויה במרכיבים נוספים כגון נוגדנים אשר רמתם בחלב בדרך כלל נמוכה, הכרה ישרה דרך קולטנים על גבי החיידקים כגון הקולטן התאי TLR (Paape et al., 2003), וסביבה מתאימה. בנוסף לפעילות הבלענית, לתאים פעילות נוספת, חוץ תאית, של שחרור רדיקאלים חופשים וציטוקינים בעלי פעילות אנטיבקטריאלית. פעילות התאים מגבירה במקביל את שחרור החומרים הכימוטקטים וגיוס מוגבר של תאים, תהליך המכונה דלקת.
Sordillo et al., 1997; Burvenich et al. 2003; Burton & Erskine, 2003; Paape et al., 2003; Rainard & Riollet, 2006).
פעילות הדלקת יורדת לאחר סילוק החיידק, ירידה בהפרשת החומרים הכימוטקטים, גיוס של מונוציטים מהדם ומקרופאג'ם מרקמות העטין וסילוק התאים המתים (Sládek et al., 2002). פעילות זו אינה חד ערכית ותלויה בסוג החיידק, בעמידותו בפני תהליך הבליעה וההרג, ובעמידותו בפני מרכיבים מסיסים נוספים בחלב.
מטרת המחקר הייתה להתמקד בשתים מהתכונות החשובות להצלחת החיידק בגרימת דלקת העטין: ניצול יעיל של המצע – חלב ועמידות החיידק בפני פעילות ההרג של נאוטרופילים וגרמים מסיסים אחרים. לצורך המחקר בודדו במשק אחד 11 בידודי חיידקי א. קולי מדלקות עטין קליניות ובמקביל 11 בידודים מסביבת הפרה. החיידקים הוגדרו על פי מבחנים פנוטפים, תכונות פיסיולוגיות של החיידקים נבחנו במעבדה. נבחנו: קצב גדילה בחלב מלא ובמצע גידול מלאכותי, פרמנטציה של לקטוז (סוכר החלב), רגישות לנסיוב בקר, וקצב הצמדות, בליעת החיידק והרג ע"י נואוטרופילים בשני מבחנים בלתי תלויים. בנוסף בוצעה הרצת DNA בשיטת פלס-פילד אלקטרופורזה (Pulse-field gel electrophoresis) ותבנית המקטעים נותחה באמצעות אנליזה מקבצית (Closter analysis).


חומרים ושיטות
בידוד חיידקי א. קולי הגדרתם ושימורם
עשרים ושנים בידודים, 11 מדלקות עטין קליניות ו-11 מסביבת הפרה נאספו במשק חלב אחד במשך כחודש. אבחון הדלקת, דיגום הרבע ואיסוף חיידקים מהסביבה בוצע ע"י וטרינר. בידודי העטין לניסוי נלקחו רק כאשר תרבית החיידקים נמצאה נקייה, עשירה, ואובחנה לפחות פעמים מתוח שלוש לקיחות עוקבות, ב 48 שעות מהתפרצות הדלקת. בידודי הסביבה נלקחו באקראי מ 25 מטושים בסביבת הפרה: עור העטין, ציוד החליבה, מרבץ ושוקת. לאחר בידוד וקבלת תרבית נקיה, החיידקים הועברו לאגר
(Tryptose Blood Agar Base, Becton-Dickinson, USA) ונשמרו ב 4 מ"צ ובנוסף, גודלו על אגר דם, נאספו, רוכזו ויובשו.
הגדרת החיידקים בוצעה בהתאם למקובל
/ National Mastitis Council methods (Hogan et al., 1999) ההגדרה הראשונית כללה, זריעה על אגר דם ולמושבות בעלות מורפולוגיה של קוליפורמים נרשם האם החיידק המוליטי או מוקויידי. הגדרה החיידק להיותו א. קולי בוצעה בפרמנטציה של:
Triple-Sugar-Iron (Becton-Dickinson, USA), Urease (Urea Agar Base, Oxoid, England with 4% Urea, Sigma, USA) and production of indole in Wittis Peptone (Proteose Peptone no. 3, Becton-Dickinson, USA).
ובעזרת ערכה מסחרית:
BBL Crystal Enteric/NF miniaturized biochemical test (Becton Dickinson, USA).


מבחן רגישות
מבחן רגישות לחומרים אנטיבקטריאלים בוצע לפי הוראות היצרן וחיתוך עמיד / רגיש לפי Barnes-Pallesen וחובריו (1987). החומרים שנבחנו היו: אמוקסילין-חומצה קבלוניק, ג'נטאמיצין, סולפה-טרמיטפרין, ניאומיצין, פולימקסין B, ו סיפוטאקסים (BBL Sensi-Disc, Becton Dickinson, USA).
O אנטיגן
קביעת קבוצת O אנטיגן נעשתה בעזרת אגלוטנציה בצלחת 96 בארות עם שמונה נסיובים כנגד 8 קבוצות של O אנטיגן (Denka Seiken Co. Ltd., Japan) בהתאם לשיטה מקובלת.
רגישות לנסיוב
נסיוב מ 6 פרות בריאות נאסף, עורבב וחולק לשנים, נסיוב פעיל וחסר פעילות. חוסר הפעילות נגרם על ידי הדגרת הנסיוב ב 56 מ"צ למשך 30 דקות לשם הפסקת פעילות המשלים. שני הנסיובים עברו סינון ב 0.2 מיקרון והוכנסו למקרר למשך 24 שעות. תרבית טרייה (16 שעות) של חיידקים נאספה, נשטפה ומספר החיידקים בכל דוגמא השווה ל 1x103 באמצעות עקומת כיול. בפלטה 96 בארות הוכנסו החיידקים (ארבעה בארות לחיידק) בנפח של 50 מיקרו ליטר ולכל שתי בארות הוספו 150 מיקרו ליטר של אחד משני הנסיובים, פעיל ובלתי פעיל. הפלטה הוכנסה לאינקובציה בכשיר קריאה אוטומטי (Tecan GENios Plus, Switzerland) בטמפרטורה של 37 מ"צ למשך 8 שעות. לאחר ההדגרה חושב ממוצע קריאת בליעת האור לשתי החזרות (הבארות), וחושב שיפוע הגדילה מזמן הדגרה 2-3 ו 2-4 שעות. שיפועי הגדילה לכל חיידק בנסיוב המטופל נקבע כערך ללא פגיעת הנסיוב ושיפועי הגדילה בנסיוב הפעיל כמדד לרגישות. חיידקים עם עקומות גדילה גבוהות נקבעו כעמידים ואלו עם עקומות גדילה נמוכות יותר כרגישים.
קצב גידול חיידקים בחלב ובמצע גידול מלאכותי
קצב הגידול החיידקים בחלב מלא ובמצע Nutrient Broth (NB) (Merck, Germany) נבחן ע"י ספירת מושבות ((CFU במשך 12 שעות. במבחנות המכילות חלב (טרי מפוסטר) או NB נזרעו 1x103 חיידקים מתרבית טרייה. מיד עם זריעת החיידקים, נלקחו דוגמאות מכל מבחנה ובוצעה זריעה במהולים עולים על פלטות אגר דם, והמבחנות הודגרו ב 37 מ"צ. אחת לשעה ועד 12 שעות נלקחו דוגמאות מכל מבחנה ותהליך הזריעה במהולים חזר על עצמו. פלטות אגר הדם הודגרו ב 37 מ"צ במשך 18 שעות ומספר המושבות בכל פלטה נספר. חישוב מספר המושבות בוצע כממוצע בפלטות המהולים בהן מספר המושבות היה בין 20 ל 250.
פרמנטציה של לקטוז
היכולת לנצל לקטוז כמקור אנרגיה יחיד נבחן ע"י גידול החיידקים במצע עני בתוספת לקטוז. תרבית טרייה של כל חיידק (1x103 מ"ל) נזרעה לשתי בארות (דופליקטים) בפלטה 96 בארות המכילות 1% לקטוז במי פפטון עם אינדיקטור לשינוי צבע עם שינוי ב pH. הפלטה הוכנסה לאינקובציה בכשיר קריאה אוטומטי ((Tecan GENios בטמפרטורה של 37 מ"צ למשך 12 שעות. המכשיר כוון לקריאה רציפה באורך גל של ( OD –nm620). לאחר ההדגרה חושב ממוצע קריאת הבליעה לכל שתי החזרות, וחושב שיפוע הגדילה.
בליעה והרג ע"י נאוטרופילים
הצמדות, בליעה והרג של החיידקים נבחן בשתי שיטות נפרדות, הצמדות ובליעה בעזרת מכשיר ה - FACS
(flow cytometry - FACS Calibur, Beckton-Dickinson, USA), והרג באמצעות ספירה מושבות על אגר דם. המבחן בוצע בחמשה ימים שונים כאשר בכל יום נבחנו מספר שווה של חיידקים מהסביבה ומהעטין וכן חיידק ביקורת שנבחן בכל ימי המבחן. מתרבית טרייה של כל בידוד, נזרעו חיידקים ממספר מושבות לתוך 10 מ"ל מי גבינה סטריליים, והודגרו במשך 3 שעות ב 37 מ"צ. בסיום ההדגרה, החיידקים נאספו, נשטפו ב PBS וסומנו בחומר זרחני(FITC) Fluorescein isothiocyanate, (Sigma) -Aldrich, Slovakia) . לאחר הדגרה של שעה ב טמפרטורת החדר, החיידקים נשטפו והובאו לריכוז של 1x103 מ"ל באמצעות עקומת כיול. במקביל להכנת החיידקים, נלקח דם ורידי מפרה (2663) במבחנת הפרין ומבחנת EDTA. מבחנת ה EDTA הועברה לספירה המטולוגית והדם במבחנת ההפרין שמש למבחן. הנסיוב הופרד, כדוריות הדם נשטפו והורחפו לנפח המקורי ב RPMI. הדם חולק למבחנות של 2 מ"ל כל אחת לפי מספר החיידקים הנבחנים ביום נתון, שניים לכל חיידק, והונח בשני סטים נפרדים. על פי תוצאות ההמטולוגיות (מספר הנואטרופילים) חושב יחס חיידקים/נואטרופילים, ולסט מבחן ההרג, יחס של 1:1.
א. מבחן הבליעה:
למבחן הבליעה, הוכנסו חיידקים ביחס של תא נואטרופיל אחד לעשרה חיידקים (1:10). מיד לאחר הוספת החיידקים וערבוב, נלקחה דוגמא (200 מקרו ליטר) והוכנסה ל 2 מ"ל PBS והעברה להמתנה לקרח. מבחנות הדם עם החיידקים הוכנסו להדגרה ב 37 מ"צ עם 5% 2CO על גבי מטלטלת. לאחר 15, 30 ו - 60 דקות הוצאו דוגמאות באותה המתכונת שבוצעה מיד לאחר הוספת החיידקים. בגמר הוצאת הדוגמאות, התאים נאספו (סירכוז (300 g, כדוריות הדם האדומות פוצצו Tris hemolytic buffer (Trizma Base, Sigma, USA)), התאים הלבנים נשטפו והורחפו ב 0.5 מ"ל. אחוז הנואטרופילים שחיידקים נצמדו ונבלעו נקבע במכשיר ה FACS ע"י ספירת 10,000 תאים. לאחר הקריאה, נאספו התאים הנותרים, הוסף (Ethidium Bromide, Sigma), התאים הודגרו במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, נשטפו והורחפו ב 0.5 מ"ל. אחוז הנואטרופילים שחיידקים נקשרו או נבלעו להם נקבע במכשיר ה FACS.
א. מבחן הרג:
למבחן ההרג, הוכנסו חיידקים ביחס של 1:1 לתרחיף נואטרופילים. מיד לאחר הוספת החיידקים וערבוב, נלקחה דוגמא (200 מקרו ליטר) והוכנסה ל 2 מ"ל PBS עם ספונין (פיצוץ התאים הלבנים) למשך 60 שניות. לאחר ערבוב בוצעה סידרת מיהולים עשרוניים ו 100 מיקרו ליטר מכל מיהול נזרע על פלטת אגר דם. המבחנות הוכנסו להדגרה בדומה למבחן הבליעה ודוגמאות נלקחו ב 30 ו -60 דקות ונזרעו באותו הפרוטוקל. ספירת מושבות וחישוב עקומות ההרג בוצעה לאחר 24 שעות הדגרה ב 37 מ"צ.
Pulsed-field gel electrophoresis.
חיידקים גודלו על מצע Brain Heart Infusion (BHI Becton Dickinson, Sparks USA) במשך 16 שעות ב 37 מ"צ, החיידקים נאספו והורחפו SE בבופר (75 mM NaCl, 25 mM EDTA, pH 7.4) בריכוז סופי של 109X1 מושבות. החיידקים עורבבו ב 2% low melting point agarose
(Agarose III, pulse field application, Amresco, Ohio USA), והוכנסו לתוך ג'ל
( plug moulds and solidified). פיצוץ החיידקים בוצע ע"י חלבון K
)proteinase K (Sigma St. Louis MO USA) in a modified EC lysis buffer (6 mM Tris-Cl, pH 7.6; 1 M NaCl; 100 mM EDTA, pH 8.0; 0.5% Brij-58; 0.2% deoxycholate; 0.5% N-lauroylsarcosine; and 20 µg/mL RNAse) at 56oC, overnight. The DNA plugs were washed four times (30 min, each) in TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA (pH 7.5) at room temperature(.
הפלגים נשמרו עד יום המבחן בבופר TE, ב 4 מ"צ. ביום המבחן הפלג בתוך תמיסת בופר רסטריקציה עם 30U of SpeI (Fermentas, Ontario, Canada) ב 37 מ"צ למשך 16 שעות. מקטעי ה DNA הופרדו ע"י ג'ל אלקטרופורזיס ב 1ץ2% אגרוז ב
CHEF-DRII module (Bio-Rad Laboratories, Hercules CA, USA)..
שמירה בפני דגרגציה של מקטעי ה DNA, בופר HEPES (16 mM HEPES-NaOH, 16 mM sodium acetate, 0.8 mM EDTA [pH 7.5])
אלקטרופורזה בוצעה ב 14 מ"צ במשך 23 שעות במקטעים של 0.5 ל 22 שניות ב 4 וולט. הג'ל נצבע ב EB במשך שעה ונשטפ במשך שעתים נוספות. הג'ל צולם ב UV טרילומינהשין. סמן סטנדרטי (מרקר) הורץ בכל ג'ל (48.5 kb-1000 kb; Bio-Rad, Ca USA) . קרבה בין תמונת קווי ה DNA ומבנה מקבצי בוצע בעזרת תוכנה מתאימה.
Cluster analysis was performed by the unweighted pair-group method using arithmetic averages (UPGMA), and DNA relatedness was calculated based on the Dice coefficient
סטטיסטיקה
כל הנתונים נותחו בתוכנת JMP (SAS Institute 2000 (, במודלים מתאימים ע"י סטטיסטיקת (דר' יוטבה לביא). המודלים הסטטיסטים מצורפים בתור נספח 1.


תוצאות
שונות גדולה נמצאה בין הבידודים בתכונות הביוכימיות, ברגישות לחומרים האנטי בקטריאליים ובקבוצות ה O אנטיגן (טבלה 1). לא נמצא קשר בתכונות אלו בין בדודי דלקת העטין ובידודי הסביבה. נמצא הבדל משמעותי מובהק (0.0001 >P) ברגישות הבידודים לנסיוב (איור 1). כל בידודי דלקת העטין, נמצאו רגישים לנסיוב בעוד ש 8/11 בידודי הסביבה נמצאו עמידים.


טבלה 1. רשמת החיידקים, מקורם, מורפולוגית המושבה על אגר דם וקבוצת ה O אנטיגן.


איור 1: התפלגות ותוצאות הניתוח הסטטיסטי לרגישות הדגרה בנסיוב של בידודי א. קולי על פי מקור החיידק (11 עטין ו - 11 סביבה).


נמצאה שונות מובהקת (0.0034 >P) בין החיידקים שבודדו מהעטין ואלו מהסביבה בקצב גידול החיידקים בחלב (טבלה 2). בידודים מדלקת העטין גדלו בחלב מהר יותר ומספרם בהגיעם לשלב הסטציונרי היה 1.5~ לוג גבוה מזה של בידודי הסביבה 1X106) לעומת (6X107 (איור A2). קצב הגידול נמצא תלוי בזמן, עד 3 שעות לא נמצא הבדל במקור החיידק, מ 4 שעות ועד סוף הניסוי ההבדלים נמצאו מובהקים. בחישוב זמן דור, נמצא כי ממוצע זמן דור של בידודי העטין עמד על 20~ דקות עם שונות קטנה בעוד שבידודי הסביבה על 40~ אך עם שונות גדולה. על כן נבחן פיזור שיפוע הגדילה בחלק הלוגריטמי של כלל הבידודים לפי מקור הבידוד ונמצא כי חיידקי הסביבה מכילים שתי תת קבוצות, האחת (4 בידודים) להם קצב גדילה דומה לבידודי העטין ו תת קבוצה שנייה (7 בידודים) עם קצב צמיחה איטי (איור 3). הבדלים אלו לא נמצאו במצע עשיר NB, כל הבידודים, לרבות תת קבוצת ה"אטיים", הראו משך דור של 20~ דקות (איור B2).


טבלה 2 מובהקות (P [F]) מקור החיידק, זמן הצמיחה והשפעת הגומלין של בידודי א. קולי מדלקת עטין או סביבת הפרה בגידול בחלב או במצע עשיר NB.


איור 2: קצב גידול ומובהקות סטטיסטית של בידודי א. קולי מדלקת עטין (11n=) או סביבה (11n=) בחלב (עליון) או מצע עשיר (NB) (תחתון).


איור 3: התפלגות ומובהקות סטטיסטית של בידודי א. קולי מדלקת עטין (11) או סביבה (11) בחלב על פי שיפוע קצב הגדילה בחלב במקטע הלוגריטמי.


נמצאה שונות מובהקת (0.01 >P) בין החיידקים שבודדו מהעטין ואלו מהסביבה ברמת הפרמנטציה של לקטוז (טבלה 3). בידודי חיידקים מדלקת העטין נצלו את הלקטוז כמקור פחמני ביעלות גבוה יותר מאשר בידודי הסביבה (איור4). השונות מובהקת ((0.05 >P) בשיפוע ניצול הלקטוז בין מקור הבידוד נמצא לאחר 240 דקות הדגרה ונשאר עד סוף הניסוי, 500 דקות (איור 4). לאור שונות גדולה יותר בבידודים מהסביבה נבחן פיזור שיפוע הגדילה בחלק הלוגריטמי של כלל הבידודים לפי מקור הבידוד ונמצא כי חיידקי הסביבה מכילים שתי תת קבוצות, כל אחת של 50%~ בידודים) אחת עם יעלות ניצול לקטוז דומה לבידודי העטין ותת קבוצה שנייה עם יעלות ניצול לקטוז נמוך (איור 5). קורלציה בין שיפוע הצמיחה בחלב ובין שיפוע ניצול הלקטוז מסוכם באיור 6. נמצאה אחידות ברוב בידודי העטין, ניצול יעיל של לקטוז וקצב צמיחה מהיר. בבידודי הסביבה, אובחנו שתי קבוצות, אחת בעלת יעלות נמוכה של תסיסת לקטוז וקצב צמיחה איטי ושנייה, הדומה בשני המדדים לבידודי העטין, יעילות תסיסת לקטוז גבוהה וקצב צמיחה מהיר.


טבלה 3. מובהקות סטטיסטית (P [F]) של פרמנטציה של לקטוז על פי מקור הבידוד: דלקת עטין (11) או סביבה (11), זמן ההדגרה והשפעת הגומלין ביניהם.


איור 4. קצב פרמנטציה של לקטוז ומובהקות סטטיסטית של בידודי א. קולי מדלקת עטין (11n=) או סביבה (11n=) .


איור 5: התפלגות ומובהקות סטטיסטית של בידודי א. קולי מדלקת עטין (11n=) או סביבה (11n=) בחלב על פי שיפוע פרמנטציה של לקטוז בקטע הלוגריטמי.


איור 6: התפלגות ומובהקות סטטיסטית של בידודי א. קולי מדלקת עטין (11) או סביבה (11) בחלב על פי שיפוע קצב הגידול בחלב במקטע הלוגריטמי ושיפוע פרמנטציה של לקטוז בקטע הלוגריטמי.


נמצאה שונות מובהקת (0.0001 >P) בין החיידקים שבודדו מהעטין ואלו מהסביבה בדינאמיקת ההצמדות והבליעה לנאוטרופילים (טבלה 4). בידודים מדלקת העטין נצמדו במידה מועטה יותר ועברו תהליך בליעה נמוך מזה של בידודי הסביבה (איור 7 ו - 8). במבחן ההרג, בידודי העטין נמצאו עמידים יותר להרג ע"י תאי הדם אך הבדל זה לא נבדל באופן מובהק מבידודי הסביבה (טבלה 4).


טבלה 4. מובהקות סטטיסטית (P [F]) של קצב הצמדות ובליעה, בליעה (FACS) והרג (ספירת מושבות), ע"י נאוטרופילים של פרה על פי מקור פי מקור הבידוד: דלקת עטין (11) או סביבה (11), הבדלים בין ימי המבחן, זמן הדגרת החיידק והשפעות הגומלין ביניהם.


איור 7: קצב הצמדות והבליעה של בידודי א. קולי מדלקת עטין (11) או סביבה (11) לנאוטרופילים מדם פרה.


איור 8: קצב הבליעה של בידודי א. קולי מדלקת עטין (11n=) או סביבה (11n=)


לנאוטרופילים מדם פרה.
במטרה לבחון האם קיים קשר בתכונות החיידקים שיבוא לידי ביטוי במבחנים השונים נערכה בדיקת רמות מתאם בין המבחנים. נמצא מתאם מובהק (0.0001 >P) בין הצמדות החיידק ובליעתו ע"י נאוטרופיליים אך בו בזמן לא נמצא מתאם בין בליעה והרג (טבלה 5). בנוסף נמצאו מתאמים שלילים מובהקים בין קצב פרמנטציה של לקטוז או קצב גידול החיידק בחלב ואחוז הבליעה, ככל שהחיידק ניצל לקטוז ביעלות רבה יותר או שקצב הגידול היה גבוה יותר כך תהליך הבליעה היה נמוך יותר.


טבלה 5. מתאם (r) בין בליעת חיידקים ע"י נאוטרופלים מדם פרה ושיפוע הצמדות החיידק לנאוטרופילים, הרג ע"י נאוטרופילים, שפוע הפרמנטציה של לקטוז ושיפוע קצב גדילה בחלב.


התפלגות 22 הבידודים על פי מקטעי ה DNA מסוכמת באיור 9. נמצא כי 18 בידודים מכילים שתי תת קבוצות כל אחת עם דמיון של מעל 79%. קבוצה אחת המכילה 8 בידודים מהסביבה והשנייה מכילה 7 בידודים מהעטין ושלושה מהסביבה. בנוסף נמצא כי 4 בידודים הנותרים מהעטין יוצרים קבוצה נפרדת עם כ 80% דמיון ביניהם.


איור 9: מיקבץ בידודי א. קולי מדלקת עטין (11) או סביבה (11) לפי מקטעי DNA והרצה ב PFGE. בידודי העטין כוללים את מספרי הפרות (לפחות 4 ספרות) וכן את בידוד מספר 506.


דיון
עבודת מחקר זו התמקדה בשאלה האם חיידקי א.קולי המבודדים מדלקות עטין קליניות מהווים תת קבוצה של החיידקים בסביבת הפרה. המחקר התמקד בשתי תכונות חשובות להצלחת החיידק בגרימת דלקת העטין: ניצול יעיל של המצע – חלב ועמידות החיידק בפני פעילות ההרג של נאוטרופילים וגרמים מסיסים אחרים. בדומה לעבודות אחרות
(Saran-Rosenzuaig et al., 1972; Sanchez-Carlo et al., 1984; Lipman et al., 1995ab; Correa & Marin, 2002; Lehtolainen et al., 2003; Wenz et al., 2006).
לא נמצאו הבדלים בין שתי קבוצות החיידקים, עטין וסביבה, במדדים מורפולוגים של מושבת החיידק, בקבוצת ה O אנטיגן וכן ברגישות לחומרים אנטיבקטריאליים. לעומת זאת, ובשונה מהספרות, נמצא הבדל מובהק ברגישות החיידקים לסרום פרה. תוצאה זו המראה כי כל בידודי העטין רגישים למרכיבי הסרום בעוד שבידודי החיידק מהסביבה רגישים. נראה כי תכונה זו אינה חשובה לחיידק התוקף את העטין. רמת מרכיבי סרום הדם בעטין ובחלב נמוכה, ובמיוחד המשלים, ולכן החיידקים גורמי דלקת עטין אינם עומדים בלחץ סלקטיבי לעמידות. בנוסף, יתכן ותוצאה זו מסבירה את מעוט המקרים בהם, גם במצבים קשים ביותר של דלקת עטין, הפרות לא נמצאות במצב של ספסיס, נגרמת דלקת עטין מקומית חריפה אך ברגע שהחיידק פורץ לדם הוא נקטל עקב רגישותו למרכיבי הנסיוב.
תנאי גידול ומצע מתאים מחד גיסא והתחמקות מהמערכת החיסונית מאידך גיסא מאפשרים לחיידק לשרוד בגוף המאכסן ובמקרים רבים להיות גורם פתוגני. חיזוק לכך נמצא בעבודה זו, חיידקי א. קולי שבודדו מדלקות עטין קליניות ניצלו באופן יעיל את המרכיב הפחמני בחלב, הלקטוז, התחלקו בקצב מהיר והגיעו למספר גדול של חיידקים תוך זמן יחסית קצר. לעומתם, רוב חיידקי א. קולי שבודדו מהסביבה לא נצלו לקטוז באופן יעיל ולכן התחלקו בקצב איטי ומספרם נמצא נמוך ב 1.5~ לוג. חשוב לציין כי תוצאה זו התקבלה רק כאשר מצע הגידול היה חלב, ולא מצע עשיר בו לא נמצאו הבדלים במקור הבידוד וכל החיידקים לרבות בידודי הסביבה התחלקו בקצב מהיר והגיעו למספר חיידקים גבוה. תוצאות אלו מצביעות על ה"תמחות", כנראה על בסיס גנטי, לנישת העטין וניצול של מקור הפחמן. תוצאות אלו תואמות לשתי עבודות קודמות Kornalijnslijper et al. 2003; reviewed by Hogan and Smith (2003)) אשר הראו כי חיידקי א. קולי המנצלים לקטוז , גדלים למספרים גבהים יותר בחלב מאשר אלו שאינם מנצלים לקטוז וכן שקיים קשר בין מספרם וריכוז הלקטוז. תכונה זו כנראה רחבה יותר מאשר לחיידקי א. קולי ונכונה גם לחיידקים אחרים, גורמי דלקת עטין, כפי שהראו (Sharer et al., 2003) לגבי סטפילוקוקוס אוראוס אשר בודד מדלקת עטין.
קצב התחלקות החיידק בבעל החיים קשור גם בהתחמקותו מהמערכת החיסונית ומרכיביה השונים, בעבודה זו נמצא כי חיידקי א. קולי שבודדו מדלקות עטין נצמדו לנאוטרופילים באופן מובהק נמוך יותר מחיידקי הסביבה, עובדה שהובילה לקצב בליעה נמוך יותר. הצמדות לתא בלעני, הינה השלב הראשון והכרחי בתהליך הבליעה. במבחן המעבדתי בעבודה זו, נשטף הנסיוב ואיתו רוב הנוגדנים (אם היו) ולכן ההיצמדות לא היתה קשורה בנוכחות מרכיב נסיוב כל שהוא. למרות זאת החיידקים שבודדו מהסביבה נצמדו במהירות גבוהה יותר לנאוטרופילים. למרות הבליעה המובהקת של חיידקי הסביבה, היחס בין קצב ההרג בין מקור החיידקים נמצא נמצא בלתי מובהק. שני מבחנים אלו, בליעה והרג נעשו בשני מבחנים שונים הראשון ב FACS והשני בספירת מושבות. יתכן שרגישות השיטות אינה אחידה ולכן עצמת ההבדלים נמצאה שונה. יחד עם זאת, הרג חיידקים אינו רק תהליך של בליעה ע"י התאים הבלענים וקיימים מרכיבים מסיסים נוספים המשתתפים בתהליך
(Paape et al., 2003; Rainard & Riollet., 2006).
תוצאה מעניינת ביותר נמצאה בחישובי המתאמים בין שתי תכונות אלו של החיידקים, קצב צמיחה והתחמקות מהמערכת החיסונית. נמצא מתאם שלילי גבוה במיוחד בין קצב צמיחה, ניצול הלקטוז ותהליך בליעת החיידקים על ידי נאוטרופילים. צמיחה מהירה ובליעה איטית של בידודי העטין, מחזקות את הנחת היסוד כי חיידקי א. קולי הגורמים לדלקת עטין קלינית בפרות התמחו למטרה זו.
חיזוק ל"התמחות" או סלקציה לתת אוכלוסיה המכוונת לעטין ניתן למצוא בניתוח תוצאות מבחן Pulsed-field gel electrophoresis. הגנומי של שתי קבוצות החיידקים. העובדה כי רוב חיידקי העטין הרכיבו שתי קבוצות בעלות דמיון רב ושונה מקבוצת חיידקי הסביבה מעלה את הסיכוי לאיתור גן או גנים ייחודיים לתת אוכלוסיה זו.
לסיכום, עבודה זו מראה בפעם הראשונה הבדלים משמעותיים המייחדים את חיידקי א. קולי מדלקות עטין בשתי תכונות עיקריות החשובות להישרדות החיידק בעטין. יחד עם זאת, עבודה זו מוגבלת לעדר אחד ויש חשיבות עליונה להרחיב מחקר זה על מנת לבחון את הממצאים, לחזקם, להתחקות לאחר השונות הגנטית.


רשימת ספרות:

Bean, A., Williamson, J., Cursons, R., T., (2004). Virulence genes of Escherichia coli strains isolated from mastitic milk. Journal of Veterinary Medicine B, 51. p. 285–287.
Bertrand, X., M. Thouverez, D. Talon, A. Boillot, G. Capellier, C. Floriot, and J. P. Helias. 2001. Endemicity, molecular diversity and colonisation routes of Pseudomonas aeruginosa in intensive care units. Intensive Care Med. 27:1263–1268.
Blood, D., C., Studdert, V., P., (1999). Saunders Comprehensive Veterinary Dictionary, 2nd ed. London, UK, Saunders. p. 700.
Blowey, R., W., Edmondson, P., W., (1995). Mastitis control in dairy herds. Ipswich, Farming Press. p. 29.
Bradley, A., J., and Green, M., J., (2000). A study of the incidence and significance of intramammary Enterobacterial infections acquired during the dry period. Journal of Dairy Sciences, 83. p. 1957-65.
Bradley, A., J., Cooper, R., Higgins, H., Thomas, L., (2001). An investigation of the relationship between the strains of Escherichia coli in the environment and those causing clinical and sub-clinical intramammary infections. in Proceedings of the National Mastitis Council's 2nd Int. Symposium on Mastitis & Milk Quality, Vancouver, BC, Canada. Nat. Mastitis Council, Inc., Madison, Wisconsin, USA. p. 165-169.
Bradley, A., J., (2002). Bovine mastitis: an evolving disease. Veterinary Journal 164. p. 116-28.
Burvenich, C., Van Merris, V., Mehrzad, J., Diez-Fraile, A., Duchateau, L., (2003). Severity of Escherichia coli mastitis is mainly determined by cow factors. Veterinary Research, 34. p. 521-564.
Correa, M., G., Marin J., M., (2002). O serogroups, eae gene and EAF plasmid in Escherichia coli isolates from cases of bovine mastitis in Brazil. Veterinary Microbiology, Mar 1, 85(2). p. 125-32
Davis M.A., Hancock D.D, Besser T.E,and Call D.R(2003). Evaluation of Pulsed-Field Gel Electrophoresis as a Tool for Determining the Degree of Genetic Relatedness between Strains of Escherichia coli O157:H7. J Clin Microbiol. 41(5): 1843–1849.
Dogan, B., Klaessig, S., Rishniw, M., Almeida, R., A., Oliver, S., P., Simpson, K., Schukken, Y., H., (2006). Adherent and Invasive Escherichia coli are associated with persistent bovine mastitis. Veterinary Microbiology, doi:10.1016/j.vetmic.2006.04.023.
Donnenberg, M., S., (2002). Escherichia coli, virulence mechanisms of a versatile pathogen. Academic Press. USA.
Döpfer, D., Almeida, R., A., Lam, T., J., G., M., Nederbragtd, H., Oliver, S., P., Gaastra, W., (2000). Adhesion and invasion of Escherichia coli from single and recurrent clinical cases of bovine mastitis in vitro. Veterinary Microbiology, 74. p. 331-343.
Douglas, M. W., K. Mulholland, V. Denyer, and T. Gottlieb. 2001. Multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa outbreak in a burns unit – an infection control study. Burns 27:131–135.
Faith, N. G., J. A. Shere, R. Brosch, K. W. Arnold, S. E. Ansay, M.-S. Lee, J. B. Luchansky, and C. W. Kaspar. 1996. Prevalence and clonal nature of Escherichia coli O157:H7 on dairy farms in Wisconsin. Appl. Environ. Microbiol. 62:1519-1525.
Grundmann, H., C. Schneider, D. Hartung, F. D. Daschner, and T. L. Pitt. 1995. Discriminatory power of three DNA-based typing techniques for Pseudomonas aeruginosa. J. Clin. Microbiol. 33:528-534.
Gyles, C., L., (1994). Escherichia coli in domestic animals and humans. Canada, CAB International. pp 117-130.
Hampton, M., B., Winterbourn, C., C., (1999). Methods for quantifying phagocytosis and bacterial killing by human neutrophils. Journal of Immunological Methods, 232. p. 15-22.
Hillerton, J., E., Berry, E., A., (2003). The management and treatment of environmental Streptococcal mastitis. The Veterinary Clinics: Food Animal Practice, 19:1. p. 157-169.
Hogan, J., Smith, K., L., (2003). Coliform mastitis. Veterinary Research 34, 507-519.
Holt, J., G., Krieg, N., R.., Sneath, P., H., A., Staley, J., T., Williams, S., T., (1994). Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 9th ed. Maryland, USA. Williams & Wilkins. p. 175.
Jalal, S., O. Ciofu, N. Hoiby, N. Gotoh, B. Wretlind. 2000. Molecular mechanisms of fluoroquinolone resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from cystic fibrosis patients. Antimicrob. Agents Chemother. 44:710-712.
Kaufmann ME (1998). Pulsed-field gel electrophoresis. In: Woodford, N, Johnson AP, editors. Molecular bacteriology: protocols and clinical applications. Totowa (NJ): Humana Press;;33-50.
Kaipainen, T., Pohjanvirta, T., Shpigel, N., Y., Shwimmer, A., Pyörälä, S., Pelkonen, S., (2002). Virulence factors of Escherichia coli isolated from bovine clinical mastitis. Veterinary Microbiology, 85. p. 37-46.
Kaper, J., B., Nataro, J., P., Mobley, H., L., T., (2004). Pathogenic Escherichia coli. Nature Reviews: Microbiology, 2. p. 123-140.
Koort J. M. K, Lukinmaa S., Rantala M., Unkila E.and Siitonen1 A.(2002) Technical Improvement To Prevent DNA Degradation of Enteric Pathogens in Pulsed-Field Gel Electrophoresis. J Clin Microbiol. 40(9): 3497–3498.
Kornalijnslijper, J., E., van Werven, T., Daemen, A., J., J., M., van den Broek, J., Niewold, T., A., Rutten, V., P., M., G., Noordhuizen-Stassen, E., N., (2003). In vitro growth of mastitis-inducing Escherichia coli in milk and milk fractions of dairy cows. Veterinary Microbiology, 91. p. 125–134.
Kornalijnslijper, J., E., Daemen, A., J., J., M., van Werven, T., Niewold, T., A., Rutten, V., P., M., G., Noordhuizen-Stassen, E., N., (2004). Bacterial growth during the early phase of infection determines the severity of experimental Escherichia coli mastitis in dairy cows. Veterinary Microbiology, 101. p. 177–186.
Leitner, G., Shoshani, E., Krifucks, O., Chaffer, M., Saran, A., (2000). Milk leukocyte population patterns in bovine udder infection of different aetiology. Journal of Veterinary Medicine, Series B, 47. p. 581-589.
Lehtolainen, T., Shwimmer, A., Sphigel, N., Y., Honkanen-Buzalski, T., Pyörälä, S., (2003) In vitro antimicrobial susceptibility of Escherichia coli isolates from clinical bovine mastitis in Finland and Israel. Journal of Dairy Sciences, 86. p. 3927-3932.
Lehtolainen, T., (2004). Escherichia coli mastitis, bacterial factors and host response. Academic dissertation. University of Helsinky. Helsinky.
Lipman, L., J., A., de Nijs, A., Lam, T., J., G., M., Gaastra, W., (1995a). Identification of Escherichia coli strains from cows with clinical mastitis by serotyping and DNA polymorphism patterns with REP and ERIC primers. Veterinary Microbiology, 43. p. 13-19.
Lipman, L., J., A., de Nijs, A., Gaastra, W., (1995b). Isolation and identification of fimbriae and toxin production by Escherichia coli strains from cows with clinical mastitis. Veterinary Microbiology, 47. p. 1-7.
Lohuis, J., A., C., M., Kremer, W., Schukken, Y., H., Smit, J., A., H., Verheijden, J., H., M., Brand, A., van Miert, A., S., J., P., A., M., (1990). Growth of Escherichia coli in milk from endotoxin-induced mastitic quarters and the course of subsequent experimental Escherichia coli mastitis in the cow. Journal of Dairy Sciences, 73. p. 1508-1514.
Longo, F., Salat, O., van Gool, F., (2001). Incidence of clinical mastitis in French dairy herds, epidemiological data and economic costs. Folia Veterinaria, 45(1): 45-46.
Mehrzad, J., Duchateau, L., Burvenich, C., (2005). High milk neutrophil chemiluminescence limits the severity of bovine coliform mastitis. Veterinary Research, 36. p. 101–116.
Nemeth, J., Muckle, C., A., Lo, R., Y., (1991). Serum resistance and the traT gene in bovine mastitis-causing Escherichia coli. Veterinary Microbiology, 28. p. 343-351.
Nemeth, J., Muckle, C. A., Gyles, C. L., (1994) In vitro comparison of bovine mastitis and fecal Escherichia coli isolates. Veterinary Microbiology, 40. pp. 231-238.
Ojeniyi, B., U. S. Petersen, and N. Høiby. 1993. Comparison of genome fingerprinting with conventional typing methods used on Pseudomonas aeruginosa isolates from cystic fibrosis patients. APMIS 101:168-175.
Paape, M., J., Bannerman, D., D., Zhao, X., Lee, J-W., (2003). The bovine neutrophil: structure and function in blood and milk. Veterinary Research, 34. p. 597–627.
Prescott, J., F., Baggot, J., D., Walker, R., D., (2000) Antimicrobial therapy in veterinary medicine, 3rd ed. Iowa State University Press. Ames. Iowa. USA.
Radostitis, O., M., (2001) Herd health: food animal production medicine, 3rd ed. Saunders, Philadelphia, PA, USA. p. 397-433.
Rainard, P., (2003). The complement in milk and defense of the bovine mammary gland against infections. Veterinary Research, 34. p. 647–670.
Rainard, P., Riollet, C., (2006). Innate immunity of the bovine mammary gland. Veterinary Research, 37.
Rementeria , A., L. Gallego, G. Quindos, J. Garaizar. 2001. Comparative evaluation of three commercial software packages for analysis of DNA polymorphism patterns. Clin. Microbiol. Infect. 7:331-336.
Rodriguez-Siek, K., E., Giddings, C., W., Doetkott, C., Johnson, T., J., Nolan, L., K., (2005). Characterizing the APEC pathotype. Veterinary Research, 36. p. 241–256.
Ormerod, M., G., (1994). Flow Cytometry, a practical approach, 2nd ed. Oxford University Press, Oxford, UK.
Sanchez-Carlo, V., Wilson, R., A., McDonald, J., S., Packer, R., A., (1984). Biochemical and serologic properties of Escherichia coli isolated from cows with acute mastitis. American Journal of Veterinary Research 45. p. 1771-74.
Saran-Rosenzuaig, A., Cohen, R., (1972). Escherichia coli serotypes isolated from cases of acute bovine mastitis in two Israeli dairy herds. Refuah Veterinarit, 29. p. 117.
Sears, P., M., McCarthy, K., K., (2003). Management and treatment of Staphylococcal mastitis. The Veterinary Clinics: Food Animal Practice, 19:1. p. 171-185.
Sela, S., O. Hammer-Muntz, O. Krifucks, R. Pinto, L. Wesblot and G. Leitner, (2007). Phenotypic and genotypic characterization of Pseudomonas aeruginosa strains isolated from mastitis outbreaks in dairy herds. J Dairy Res. 74:426-430
Sharer, M., V., Su, C., Hegde, N., V., Jayarao, B., M., Sordillo, L., M., (2003). Differential expression of the lactose transporter gene affects growth of Staphylococcus aureus in milk. Journal of Dairy Sciences, 86. p. 2373–2381.
Shpigel, N., Winkler, Y., Ziv, M., G., Saran, A., (1998). Clinical, bacteriological and epidemiological aspects of clinical mastitis in Israeli dairy herds. Preventive Veterinary Medicine, 35. pp. 1-9.
Sládek, Z., Ryšánek, D., Faldyna, M., (2002). Activation of phagocytes during initiation and resolution of mammary gland injury induced by lipopolysaccharide in heifers. Veterinary Research, 33. p. 191–204.
Songer, J., G., Post, K., W., (2005). Veterinary Microbiology, bacterial and fungal agents of animal disease. Elsevier Saunders. USA. pp. 113-119.
Sordillo, L., M., Shafer-Weaver, K., DeRosa, D., (1997). Immunobiology of the mammary gland. Journal of Dairy Sciences, 80. p. 1851-1865.
Spencker, F. B., S. Haupt, M. C. Claros, S. Walter, T. Lietz, R. Schille, and A. C. Rodloff. 2000. Epidemiologic characterization of Pseudomonas aeruginosa in patients with cystic fibrosis. Clin. Microbiol. Infect. 6:600–607.
Vangroenweghe, F., Rainard, P., Paape, M., Duchateau, L., Burvenich, C., (2004). Increase of Escherichia coli inoculum doses induces faster innate immune response in primiparous cows. Journal of Dairy Sciences, 87. p. 4132-4144.
Wenz, J., R., Barrington, G., M., Garry, F., B., McSweeney, K., D., Disnmore, R., P., Goodell, G., Callan, R., J., (2001). Bacteremia associated with naturally occurring acute coliform mastitis in dairy cows. Journal of the American Veterinary Medical Association, 219:7. p. 976-981.
Wenz, J., R., Barrington, G., M., Garry, F., B., Ellis, R., P., Magnuson, R., J., (2006). Escherichia coli isolates’ serotypes, genotypes and virulence genes and clinical coliform mastitis severity. Journal of Dairy Sciences, 89. p. 3408-3412.
Wise, A., J., Hogan, J., S., Cannon, V., B., Smith, K., L., (2002). Phagocytosis and serum susceptibility of Escherichia coli cultured in iron-deplete and iron-replete media. Journal of Dairy Sciences, 85. p. 1454-1459.

 

 

נספח 1.

Statistical Analysis
Differences between the distribution of genetic groups, serogroups and complement resistance in the two bacterial sources (i.e. environment vs. mastitis) was determined by Pearson chi square (χ2) test.
The effect of the bacterial source and the time of detection on the growth in milk or on lactose fermentation was subjected (separately) to a two-way ANOVA model with a repeated-measurements (“split-plot”) design using Source and Time as main effects. Source was tested against the between-samples error, and Time and Time X Source interaction was tested against between-time within-sample error (random error). The statistical model was:
Model [1]:

 = Mean of all data.
 = The difference between the mean of Source i from the trial mean.
 = Variance between sample within Source i (Error 1).
 = The difference between the mean of Time k from the trial mean.
 = Interaction between Source and Time.
 = Residual of the measurements of Source i, Sample j and Time k (Error 2).
Multiple compression between sequential measurements was done using Student t' test. Moreover, linear range and slope of the log phase were compared between the bacteria from mastitis and from the environment using regression lines. Comparison between the variance and mean of these slopes was done using Bartlett and t-test, respectively. Correlation between the slopes calculated for growth in milk and lactose fermentation was done separately for bacteria from the mastitis and bacteria from the environment.
The data on the Phagocytosis percentage, Adhesion percentage and killing percentage was subjected (separately) to a three-way ANOVA model with a repeated-measurements (“split-plot”) design using Source and Time as the fixed main effects and Date (five dates of examination) as random effect. Source and Date was tested against the random effect of the Source X Date interaction, Source X Date interaction effect was tested against the between-samples within date and source error, and Time and Time X Source interaction was tested against between-time within-sample error (random error). The statistical model was:
Model [2]:

 = Mean of all data.
 = The difference between the mean of Source i from the trial mean (Fixed effect).
= Variance between Dates (random effect).
 = Interaction between Source and Date (random effect).
 = Variance between sample within Date j and Source i (Error 1).
 = The difference between the mean of Time k from the trial mean (fixed effect).
 = Interaction between Source and Time (Fixed effect).
 = Residual of the measurements of Source i, Sample j and Time k (Error 2).
Multiple compression was done using Tukey-Kramer HSD t' test. Correlation between the % killing. % adhesion and % phagocytosis measured after 30 min or 60 min was determined.
All statistical analyses were carried out with JMP software (SAS Institute, 2000).

לכל המבזקים....
office@milk.org.il פקס: 972-3-9564766 טל: 972-3-9564750 דרך החורש 4 , ת"ד 97, יהוד 5647003
מופעל באמצעות מעוף - מגוון אפקט