מערכות אנזימטיות בחלב: תפקידם, חשיבותם וניצולם לשיפור איכות החלב ומניעת נזקים הקשורים לדלקות עטין


חכנית 362-0072-06
דו"ח לשנת 2006: דוח סופי


נ. סילניקוב, המכון לבע"ח, מינהל המחקר החקלאי
ע. מרין, המעבדה לחלב
ג. לייטנר, המכון הוטרינרי


תקציר
בשנים האחרונות ישנה עלייה במודעות הן בעולם הרחב והן בארץ לצורך לייצר מוצר שיענה לא רק על קריטריונים כלכלים (כגון תפוקה, יעילות ייצור וכד.), אלא גם יעמוד בסטנדרטים גבוהים של איכות המוצר (ראה קול קורא BARD FP6  , מדען ראשי). לפי נתוני המעבדה המרכזית לחלב כ- 40 עד 60% מהפרות נגועות בדלקת תת-קלינית, דהיינו, החשיפה לחלב נגוע ע"י הציבור היא רבה. בתכנית 354-0156-03 הראנו שדלקת תת קלינית מתבטעת בייצור מוגבר של רדיקלים חופשים  (מי חמצן, ניטריק אקסיד וניטריק אוקסיד) ע"י תאי העטין וכדוריות דם לבנות ע"י מערכות אנזימטיות ייחודיות (ניטריק אוקסיד סינטטאז, וקסנטין אוקסירדוקטאז ולקטפראוקסידאז). במקביל ישנה ירידה בפעילות האנטי-אוקסידנטית של החלב עקב ירידה בריכוז של ח. אסקורבית (וויטמין C). מטרות המחקר הן: נטור השפעת דלקת תת-קלינית על ידי חיידקים שונים  כגון, סטפילוקוקים, סטרפטוקוקים וקוליפורמים) על הרכב החלב בפרות , חמצון שומן וחלבון, והשפעת שינויים אלו על ייצור גבינות.מטרת המחקר בשנה ב להראות שהאנזים קסנטין אוקסידאז פעיל בחלב ומושפע מסוג החיידק בעטין תוצאות המחקר הראו שהסובסטרטים של קסנטין אוקסידאז, קסנטיו והיפוקסנטין עוברים מטבוליזים מהיר (תוך 30 דקות) לחומצה אורית לכן ניתן להסיק שכל התהליך מתבצע בנאדיות החלב (אלוואוליס), ופעילות האנזים באתר הזה מהווה הגנה פעילה מפני התישבות של חיידקים בתאי האפיתל של בלוטת החלבץ לעומת זאת "באכילה" של הסובסטרטים לקסנטין אוקסידאז מתבטעת בחוסר פעילותו בחלל הבלוטה ומונעתנזק אוקסידטיבי לחלב בזמן אגירתו בבלוטה בין 2 חליבות.
בעבודה זו הראנו גם שהחיידקים א. קולי ו ס. דיסגאלקטיה גורמים להפעלה ספציפית של הנזים קסנטין אוקסידאז, עובדה העשויה להסביר את ההנטיה להעלמותם המהירה בזמן אינפקציהת אך גם את הנזקים הנקרוטים (במקרה של א קולי) והנזק לאיכות החלב (במקרה של ס. דיסגלקטיה), כאשא הבלוטה מודבקת בחחידקים אלו. לעומת זאת הדבקה בחיידקים סביבתיים (CNS), אן ס. אוראוס, לא משפעלת את האנזים קסנטין אוקסידאז, עובדה היכולה להסביר את הנטייה להפיכת דלקות המאויפפינות בהדבקה בחיידקים אלו להדבקות כרוניות.

 

2.1 מבוא ותאור הבעיה
אחד הגורמים העיקריים המשפעים על איכות החלב קשור במצב בריאות העטין.  קיים מתאם חיובי בין נוכחותו של גורם מזהם בחלב, בעיקר חיידקים, ובין ירידה באיכות החלב. נוכחות החיידקים משפיעה על הרכב החלב כגון ירידה בריכוז קזאין ולקטוז ועלייה במספר התאים הסומטים. רמת התאים הסומטים מהווה כיום את המדד העיקרי לקביעת האיכות הבריאותית של חלב בקר; כאשר היצרן מקבל תמריץ על שיווק חלב עם מס' נמוך של תאים סומטים וקנסות על שווק חלב עם רמת תאים סומטים מעל לתקן. התאים הסומטים הנם בעיקרם תאי דם לבנים הנמצאים באופן טבעי בחלב. רמה גבוהה מעל הרגיל בתאים סומטים קשורה כמעט תמיד לנוכחות של פתוגן בחלב ( 3 2, 1). בנוסף לכך, צריכה של חלב עתיר בתאים סומטים אינו רצוי עקב חשש לתגובות אלרגיות. ללא גורם מזהם, מס התאים הסומטים בבקר נע בין 2500 ל-100000 תאים למ"ל חלב. בנוכחות חיידק מזהם הגורם לדלקת קלינית, עולה מס' התאים הסומטים ללמעלה ממליון תאים למ"ל חלב. חיידקים המזהמים את העטין וגורמים לדלקת תת-קלינית מעלים את מס התאים הסומטים בבקר לסביבות 600000 תאים למ"ל חלב. התקן בארץ אינו מאפשר קליטת חלב שמס' התאים הסומטים עולה על 650000 תאים למ"ל חלב. העובדה שבמרבית המקרים רק רבע אחד נגוע בדלקת תת-קלינית, מאפשרת קליטת חלב זה למחלבות בהתאם לתקן. יחד עם זאת, יש לציין שידוע מעט מאוד על השינויים בהרכב החלב כתוצאה מדלקת תת-קלינית. לפי נתוני המעבדה המרכזית לחלב כ- 40 עד 60% מהפרות נגועות בדלקת תת-קלינית, דהיינו, החשיפה לחלב נגוע ע"י הציבור היא רבה.

 

אחד הבדיקות הסטנדרטיות ע"י המחלבות הגדולות לניתור איכות החלב הנה בדיקה לפעילות לחומרים מעכבים, שמטרתה לאבחן חלב ששווק עם שאריות של חומרים אנטיביוטים.  מבדיקות כאלו  נמצא גם במדינות אחרות וגם בארץ פעילות של חומרים מעכבי גידול חיידקים, גם כאשר ברור שהפרות מהן נלקח הדוגמה לא טופלו כלל בתכשיר אנטיביוטי. העלייה בשכיחות תגובות חיוביות לטפול בחומר אנטיביוטי ללא טפול באנטיביוטיקה עולה בפרות עם דלקת עטין כרונית או תת כרונית, או בפרות לקראת סוף התחלובה. במדינות בהם הרבייה היא עונתית (כמו ניוזילנד), ברור גם שאיכות החלב לייצור גבינה פוחת במידה נכרת לקראת סוף התחלובה. במחקר שנעשה במסגרת תכנית 354-0156-03   התגלה שהמקור לפעילות של החומרים מעכבי גידול חיידקים הוא ייצור מוגבר של רדיקלים חופשים  (כגון מי חמצן וניטריק אוקסיד) ע"י תאי העטין וכדוריות דם לבנות ע"י מערכות אנזימטיות ייחודיות (ניטריק אוקסיד סינטטאז, וקסנטין אוקסירדוקטאז ולקטפראוקסידאז) (4). במקביל ישנה ירידה בפעילות האנטי-אוקסידנטית של החלב עקב ירידה בריכוז של ח. אסקורבית (וויטמין C). הפעילות האוקסידנטית הנה ככל הנראה מרכיב  חשוב בהגנה הטבעית מפני פתוגנים, אך פעילות זו עשויה לפגוע באופן שלילי על ייצור גבינה ואיכות החלב כתוצאה מחמצון של מרכיבים שומנים וחלבונים בחלב. ככל שידוע לנו, הידע בתחום ספציפי זה הנו זעום ולכן תוספת ידע תתרום לענף החלב בכללותו.  במידה ונבסס את הקשר השלילי בן ייצור חומרים רדיקלים לייצור גבינות ואיכות התזונתית של החלב, ניתן יהיה לפתח בקלות יחסית שיטה, כגון פיסטור ראשוני של החלב במשק, או העשרת החלב באנטיאוקסידנטים הנמצאים בו באופן טבעי, למניעת נזקי החמצון עוד בשלב אסוף החלב במשק.
במסגרת תכנית 354-0156-03 נמצא קשר שלילי בין דלקות עטין תת קליניות לאיכות החלב וייצור גבן בכבשים ועיזים ובקר (3, 1,2).

 

2.2 מטרות המחקר
מטרות המחקר הן:
1. להראות האנזים קסנטין אוקסידאז פעיל בחלב באמצעות הפיכת קסנטין לחומצה אורית בצימוד ליצירת מי חמצן.

2. לבדוק כיצד הפעילות של האנזים מושפעת מאינפקציה בחיידקים נפוצים בדלקות תת קליניות.

 

2.2.1.

 

3.   חומרים ושיטות
העבודה נערכה בחלב נקי מחיידקים שניגם משש פרות נקיות מחיידקים (לפי בדיקה בקטריולוגית במעבדתו של לייטנר) תוך 12 שעות בהוואה לחלב שנדגם לאחר 2 זריקות עובות של אוקסיטוצין (20 יחידות בין לאומיות). החלב האחרון מייצג חלב שנוצר בדקות האחרונות, ואילו חלב שנידגם בזמן החליבה מייצג חלב ששהה 8 שעות בבלוטת החלב.
השיטות האנליטיות ( קביעת פעילות קסנטין אוקסידא, הפיכת קסנטין לאוראט ריכוז ניטרט וחומצה אורית וסוגי התאים בחלב) מתוארים ברפרנס מספר 8

 

4. תוצאות

בגרף מס 1 מוצגות תוצאות המראות שבחלב טרי קסנטין הופך לאוראט תוך 30 דקות והתהליך מעוכב ע"י מעכב של קסנטין אוקסידאז. התוצאות מראות שמקור אוראט בחלב הוא הפרשה של קסנטין או היפוקסנטין לחלל הבלוטה.


גרף. 1: הפיכת קסנטין לאוראט עם ובלי מעכב לקסנטין אוקסידאז לאורך זמן בחלב טרי המוחזק ב-37 מעלות צזסיוס

 

 

 

בגרף מס 2 מוצגות תוצאות המראות שהוספת קסנטין לחלב שנדגם בזמן החליבה גורמת להפיכתו תוך 30 דקות לחומצה אורית. הוספת מעכב ספציפי לקסנטין אוקסידאז מעכבת את התהליך. התוצאות מראות שהאנזים קסנטין אוקסידאז אנו פעיל בחלל בלוטת החלב עקב "אכילת" הסובסטרט בנאדיות החלב

 

גרף 2. הפיכת קסנטין לחומצה אורית עם ובלי מעכב לקסנטין אוקסידאז  בחלב שנידגם בזמן החליבה

 

 

בטבלה מספר 1 מודגם שהדבקה בא. קולי וס. דיקלגטיה מעלה את הלחץ האוקסידטיבי בחלב, כפי שמתבטא בעלייה בריכוז של ניטרט וחומצה אורית. לעומת זאת  הדבקה ב-ס. אוראוס וב-CNS לא גרמה לשינוים אלו.

 


בטבלה מספר 2 מודגם כי באותם החיידקים שעלה בהם הלחץ הוקסידטיבי, עלה בצורה מובהקת יותר גם מספר הלויקוציטים, בעיקר אלו מסוג PMN.


 

 

7. דיון ומסקנות
תוצאות המחקר הראו שהסובסטרטים של קסנטין אוקסידאז, קסנטיו והיפוקסנטין עוברים מטבוליזים מהיר (תוך 30 דקות) לחומצה אורית לכן ניתן להסיק שכל התהליך מתבצע בנאדיות החלב (אלוואוליס), ופעילות האנזים באתר הזה מהווה הגנה פעילה מפני התישבות של חיידקים בתאי האפיתל של בלוטת החלבץ לעומת זאת "באכילה" של הסובסטרטים לקסנטין אוקסידאז מתבטעת בחוסר פעילותו בחלל הבלוטה ומונעתנזק אוקסידטיבי לחלב בזמן אגירתו בבלוטה בין 2 חליבות.
בעבודה זו הראנו גם שהחיידקים א. קולי ו ס. דיסגאלקטיה גורמים להפעלה ספציפית של הנזים קסנטין אוקסידאז, עובדה העשויה להסביר את ההנטיה להעלמותם המהירה בזמן אינפקציהת אך גם את הנזקים הנקרוטים (במקרה של א קולי) והנזק לאיכות החלב (במקרה של ס. דיסגלקטיה), כאשא הבלוטה מודבקת בחחידקים אלו. לעומת זאת הדבקה בחיידקים סביבתיים (CNS), אן ס. אוראוס, לא משפעלת את האנזים קסנטין אוקסידאז, עובדה היכולה להסביר את הנטייה להפיכת דלקות המאויפפינות בהדבקה בחיידקים אלו להדבקות כרוניות.
המסקנות העיקריות מן נסוי מסוכמות באופן סכמטי במודל המוצג בציור 3:

 

Fig. 3.
Posttranscriptional regulation of Xanthine oxidase in the milk by its substrates: hypoxanthine and xanthine.
One of the final products of metabolic pathway of purines, most likely hypoxanthine, is transported to milk through the apical membrane of the epithelial cells composing the alveoli by yet an unidentified transport system. In the gland lumen (milk) hypoxanthine is being converted to xanthine and xanthine to uric acids. In both reactions the release of electron from the double bonds in hypoxanthine and xanthine is used to produce hydrogen peroxide [5]. In turn, hydrogen peroxide is used by catalase to convert nitrite into nitrate and by lactoperoxidase to convert nitrite into nitric dioxide radical [5]. The oxidative reductive state of milk and consequently the ability of milk to release substance that fight the bacteria invading to the gland and conversely to prevent damage to the milk food quality and damage to the mammary tissue are dictated to a large extend by hydrogen peroxide produced by XO and the balance between these two reactions.

 

 


8. מסקנות אפליקטיביות
1. מחסור בהפרשת קסנטין לחלב עשוי לפגוע בכושר ההגנה של הבלוטה מפני פלישת חיידקים ואת רגישותו לעקה חמצונית. ידוע שתחילת תקופת ההנבה הנה תקופה מועדת לפורענות מבחינת ההדבקות בחיידקים. יתכן שמחסור בהפרשת קסנטין בתקופה זו תורם לבעייה?

2. חלב בלתי מפוסטר עובר באופן מתמיד תהליכי חמצון. מתוצאות נסויי שנה ג עולה שניתן להקטין נזק זה ע"י הוספה מבוקרתשל קסנטין לחלב. התוצר, אוראט, הנו מרכיב טבעי בחלב, התורם גם הוא לתכונות הנוגדות חימצון של החלב.

 

פרסומים רלוונטים של החוקרים

1. Leitner, G., Chaffer, M., Shamay, A., Shapiro, F., Merin, U., Ezra, E., Saran, A. and Silanikove, N. 2004a. Changes in milk composition as affected by subclinical mastitis in sheep. J. Dairy Sci., 87:46-52.
2. Leitner, G., Merin, U. and Silanikove, N. 2004b. Changes in milk composition as affected by subclinical mastitis in goats. J. Dairy Sci., 87:1719-1726.
 3. Leitner, G., Krifucks, O., Silanikove, N. and Merin, U. 2005.  Interactions between bacteria type, proteolysis of casein and physico-chemical properties of bovine milk. Int. Dairy J., in press
4. Silanikove,  N., Shapiro, F., Shamay,  A. and Leitner, G. 2005.                       
  Role of xanthine oxidase, lactoperoxidase, and NO in the innate immune system of mammary secretion during active involution in dairy cows: manipulation with casein hydrolyzates.                                                                                                                     Free Radicals Biol. Med., 38: 1139-1151.
5. Leitner, G., Krifucks, O.,. and Merin, U. Silanikove, N. 2006. Interactions between bacteria type, proteolysis of casein and physico-chemical properties of bovine milk. Int. Dairy J., in press
6. Silanikove, N; Merin, U; Leitner, G. 2006. Physiological role of indigenous milk enzymes:  An overview of an evolving picture. Int. Dairy J., in press,  2005.

 

רשימת ספרות


1. Leitner, G., Chaffer, M., Shamay, A., Shapiro, F., Merin, U., Ezra, E., Saran, A. and Silanikove, N. 2004a. Changes in milk composition as affected by subclinical mastitis in sheep. J. Dairy Sci., 87:46-52.
2. Leitner, G., Merin, U. and Silanikove, N. 2004b. Changes in milk composition as affected by subclinical mastitis in goats. J. Dairy Sci., 87:1719-1726.
 3. Leitner, G., Krifucks, O., Silanikove, N. and Merin, U. 2005.  Interactions between bacteria type, proteolysis of casein and physico-chemical properties of bovine milk. Int. Dairy J., in press
4. Silanikove,  N., Shapiro, F., Shamay,  A. and Leitner, G. 2005.                       
  Role of xanthine oxidase, lactoperoxidase, and NO in the innate immune system of mammary secretion during active involution in dairy cows: manipulation with casein hydrolyzates.                                                                                                                     Free Radicals Biol. Med., 38: 1139-1151.
5. Osawa CC, de Felicio PE, Goncalves LAG. 2005. TBA test applied to meats and their products: Traditional, modified and alternative methods. Quimica Nova 28: 655-663
6. Tanaka, S Choe, N Hemenway, DR  Zhu, S. Matalon, S.  Kagan, E. 1998. Asbesto Inhalation Induces Reactive Nitrogen Species and Nitrotyrosine Formation in the Lungs and Pleura of the Rat. J. Cin. Inves. 102, 445-454.
7. Fagan, JM. Sleczka, BG Sohar, I. (1999). Quantitation of oxidative damage to tissue proteins. Int. J. Biochem. Cell Biol. 31, 751-757.
8. Silanikove,  N., Shapiro, F., Shamay,  A. and Leitner, G. 2005.                       
  Role of xanthine oxidase, lactoperoxidase, and NO in the innate immune system of mammary secretion during active involution in dairy cows: manipulation with casein hydrolyzates.                                                                                                                     Free Radicals Biol. Med., 38: 1139-1151.

 

לכל המבזקים....
office@milk.org.il פקס: 972-3-9564766 טל: 972-3-9564750 דרך החורש 4 , ת"ד 97, יהוד 5647003
מופעל באמצעות מעוף - מגוון אפקט