בדיקת שימוש בשטת ה- PCR כאבחון תומך לביוטיפיזציה של זני ברוצלה במדינת ישראל.
ד"ר ס. ברדנשטיין - חוקר ראשי
גב מירי באום, ד"ר מ. בנאי - חוקרים משניים
Evaluation of the application of the PCR method to support Brucella biotyping in Israel
תקציר
ברוצלוזיס היא מחלה זואונוטית הנגרמת ע"י חיידקים גרם-שליליים מהסוג ברוצלה. במאכסן, החיידק חי לרוב כטפיל תוך תאי. הסוג ברוצלה מורכב מ 6 מינים המאופיינים בין השאר, על פי זיקתם למאכסן הטבעי בו הם גורמים להפלה. בישראל הצליחו לבער את B. abortus אך נגיעות הצאן ב B. melitensis יוצרת מקור קבוע להדבקת פרות. למניעת המחלה בבע"ח פותחו זני חיסון חיים, ממוירים, בהתאם למאכסן: זן 19B. abortus לבקר וזן B. melitensis Rev 1 לצאן. בשנים האחרונות פותח בארה"ב לשימוש תרכיב RB51 לחיסון הבקר. זן RB51 הינו מוטנט של גזע B. abortus אלים, 2308, שבהעברות במעבדה אבד את אנטיגן הפוליסכריד ובמקביל נחלשה אלימותו. בשנים האחרונות הראינו התפתחות של זני ברוצלה מליטנזיס ייחודיים בישראל, ביניהם מליטנזיס במבנה מחוספס וכן, הדבקה של צאן בזן התרכיב Rev.1. בנוסף, לאור התפרצויות של ברוצלה מליטנזיס בבקר לחלב, נוצר צורך לאפיון מדויק של הבידודים באופן מהיר ומדויק.
בדו"ח זה אנחנו מסכמים החלת שיטת ה – PCR לאפיון בידודים של זנים מקומיים. השיטות הבקטריולוגיות המקובלות לזיהוי הזנים והביווארים השונים של הברוצלה אורכות לפחות 5 ימים. שטת ה- PCR נותנת תוצאות ראשוניות בפרק זמן של 24 שעות.
בדקנו ב – PCR זני ייחוס של מליטנזיס, אבורטוס וסויס ברמת המין על בסיס IS711 בשיטת AMOS וע"י הגברה של omp2 . בנוסף, השתמשנו בתחלים ייחודים שנמצאו מאפיינים לזני החיסון B. melitensis Rev.1, abortus S19; B. abortus RB51. B. תוצאות ה - PCR הושוו לאלו המתקבלות בשיטות הבקטריולוגיות התקניות. לאחר שהראינו התכנות השיטה, בדקנו בידודים מארועים בצאן ובבקר ואפיינו גורם המחלה. הראינו כי בידוד מצאן היה במקרה מסוים מזן התרכיב אבורטוס S19, וברפת פרות לחלב היה בידוד מעורב שכלל פרה חולה בזן 19 ושתיים אחרות חולות בזן מליטנזיס.
רקע מדעי
חידקי הברוצלה הם מחוללי מחלת הברוצלוזיס בבע"הח החקלאיים, צאן, בקר וחזירים. המחלה היא זואונוזה וככזו היא מועברת מבעה"ח לאדם. מבחינה טקסונומית החיידקים משויכים לקבוצת הגרם שלילי, וגודלם נע בין חצי מיקרון באורך ו0.2- עד 0.5 מיקרון ברוחב, בצורת מתג מעוגל. הסוג מחולק לששה מינים כדלקמן:
1. ברוצלה מליטנזיס (Brucella melitensis)
2. ברוצלה אבורטוס(Brucella abortus)
3. ברוצלה סויס (Brucella suis)
4. ברוצלה נאוטומה (Brucella neotomae)
5. ברוצלה אוויס (Brucella ovis)
6. ברוצלה קניס(Brucella canis)
ההצדקה לחלוקה מבוססת על בסיס שלש תכונות מרכזיות: מטבוליזם חימצוני, רגישות לפאג' וזיקה למאכסן טבעי, אבל המינים כמעט זהים ברמת הDNA (כ - 95%).
חלוקת הסוג לששה מינים נותרה מקובלת בעיקר משום הנוחות בשימוש במעקב אפידמיולוגי אחר מקורות הזיהום בעת הדבקה חדשה של משק בע"ח. העובדה שקיימת זיקה חד משמעית בין מין הברוצלה ומין בע"הח מאפשרת להגדיר נפיצות המין ברמה הארצית ובהתאם, לקבוע מדיניות לבקרה (control) של המחלה. כל מין ברוצלה הינו גורם הפלה במין בע"הח כלפיו קיימת הזיקה. תתכן הדבקה של בע"ח ממין אחר, אך זו לא תהיה מלווה בהפלות. בזכרים גורמת המחלה להתפתחות דלקת באשכים, הבאה לביטוי כאפידידימיטיס (epididymitis) או אורכיטיס .(orchitis) ההפלה או דלקת האשכים הינם הסימנים הקלינים הכמעט יחידים למחלה. לעתים רחוקות ניתן לראות ירידה בחיוניות של הבהמה. בדרך כלל, הפלה תגרם רק פעם אחת ולאחריה יהיו הריונות תקינים. לאחר ההריון, החיידק יופרש בד"כ בחלב.
B. melitensis הינו מחולל מחלה בצאן. עזים הן המאכסן הטבעי וכבשים הן המין המועדף, אך הפלה נגרמת בשני מיני בע"הח. B. abortus הינו מחולל מחלה בבקר, אך גם בבע"ח עם קרבה גנטית כמו בופאלו וביזון. B. suis הינו מחולל מחלה בחזירים, B. neotomae בחולדות יער, B. ovis בזכרים של הצאן (אילים) ו - B. canis בכלבים. באזורים נגועים בחיידק ממין מסוים תתכן הדבקה של בע"ח שאינו מאכסן טבעי. כך, נמצא ש B. abortus גרם להדבקת כבשים, וכן גמלים. מאידך, B. melitensis גרם להדבקת בקר. במקרים נדירים נמצאה הדבקת כלבים בחיידק melitensis אך בד"כ חשיפה לחיידק מסתיימת בהתפתחות תגובת נוגדנים בלבד (1).
דרכי ההעברה החשובות של המחלה מבע"ח לאדם הן באמצאות שתיית חלב טרי נגוע או אכילת מוצרי גבינה שהוכנו מחלב נגוע. בין הגורמים המקצועים (רופאים וטרינרים, מגדלים, ושוחטים בבתי מטבחיים) הדרך הנפוצה להדבקה היא במגע ישיר עם חומר מזוהם. ברוצלה באדם יכולה לגרום לביטויים שונים של המחלה. בד"כ, המחלה דומה לשפעת. מאפיינים אותה חום משתנה (Undulant) שהינו גבוה בשעות הבוקר ונמוך אחה"צ. אז מופיעות צמרמורות מלוות בזעה. המחלה באה לביטוי בחולשה כללית ובכאבי ראש בעיקר בחלק המצח. חוסר אבחון מוקדם יכול להוליך להתפתחות מחלה כרונית. בנוסף, יתכנו מצבים של מחלה ללא סימנים קליניים (asymptomatic). המחלה יכולה להיות חבויה למשך זמן ארוך ביותר, שימשך שבועות ואף חודשים (latent)(2).
האבחון הסרולוגי מבוסס על מבחנים שתוקנו ברמה הבינלאומית. היות והסטורית ברוצלה אבורטוס בבקר היתה מוקד לבעיה המשקית בארצות המערביות כל שיטות האבחון הסרולוגי פותחו לניטור ומעקב אחרי עדרי בקר לחלב. לפיכך, נוסדו מרכזים בינלאומיים מוכרים של ה – OIE והם תקנו את המבחנים הסרולוגיים על פי מדד קבוע של ה-
(2nd International anti Brucella abortus Serum).
תרכיב אבורטוס מוחלש שנקרא זן 19 פותח ע"יCotton , Buck ו-Smith בשנת 1934. החוקרים הראו כי הזן המוחלש הקנה עמידות חיסונית לבקר (3). מאז, נעשה שימוש רחב מימדים בתרכיב בכל רחבי העולם. למרות ההצלחה נרשמו מספר בעיות שחייבו המשך החיפוש אחרי תרכיב מוצלח יותר. שתי בעיות מרכזיות נצפו: הראשונה, חיסון בהמות בהריון גרם להפלה (4). השניה, הזהות האנטיגנית בין זן התרכיב וזן האם הולידה התפתחות נוגדנים נגד ה- Smooth LPS כפי שקיים בארוע מחלה (5). לאחרונה, הרעיון של שימוש בזן תרכיב חי, מוחלש, במצב אנטיגני מחוספס לחיסון בבקר חזר להיות ממשי לאחר שד"ר Gerhardt Schurig פתח, בשנת 1990, את זן אבורטוס RB51 ע"י סלקציה לעמידות לפניצילין ולרימפמיצין (Rifampicin). הזן גדל במצב מחוספס קבוע ולא נמצאו בו שינויים חזרה למצב חלק (6). מצב אנטיגני מחוספס הינו נחות לעומת מצב אנטיגני חלק בכל הנוגע לאלימות ולפיכך הזן נמצא שימושי כזן תרכיב. בניסיונות שנעשו עם הזן, הן בחיות מעבדה והן בבקר, נמצא שהתרכיב מקנה חיסון יעיל לפחות כמו זן 19. בהיותו מחוספס החיסון אינו מעורר נוגדנים נגד מרכיב ה- Smooth LPS של חיידק השדה ולפיכך, החיסון אינו מפריע בבדיקות הסרולוגיות. כך, ניתן להשתמש בתרכיב בחיסונים חוזרים ללא הפרעה למעקבים אחרי מצב נגיעות בעדרים, והשימוש בתרכיב אפשרי בזכר ובנקבה, בצעיר ובבוגר. לאחר שהוכחו יעילות התרכיב ובטיחותו הוחלט בפברואר 1996, לאמצו בארה"ב כשיטת החיסון היחידה המאושרת (7).
שיפוט תוצאות החיסון בבקר לגבי משטר ברוצלוזיס קשה להשגה. מחד, ברוצלה אבורטוס בוערה בישראל החל משנת 1984 בבקר לחלב ו – 1985 בבקר לבשר (10, 9, 8). יותר מכך, הקפדה על הגבלת גיל החיסון לעגלות צעירות בלבד הורידה למימדים זניחים את נוכחות הנוגדנים לברוצלה בעדרי החלב ולפיכך ייעלה את יכולת האבחון באופן מובהק. וגם, הפרשה מתמדת של זן החיסון ע"י פרות מחוסנות חוסלה כמעט לחלוטין. כיום, מספר המקרים המאובחנים המיוחסים לזן החיסון שואף לאפס. לעומת זאת, מדינת ישראל רשמה מספרים מדאיגים של אירועי ברוצלה מליטנזיס בבקר לחלב. באחד מהמקרים ניתן היה לשייך הפלות בבקר לחלב בוודאות כתוצאה מנגיעות בברוצלה מליטנזיס. תופעה זו של הדבקה למרות חיסון מלמדת על יעילות מוגבלת של התרכיב ברמת הפרט ויתכן, שבשלבים של התבססות המחלה ברפת גם על כשל חיסוני כולל במצב של הוקעה מוגברת במיוחד.
תוצאות דומות נצפו גם בצאן בהן ניתן היה להראות הדבקה מעורבת בו זמנית של הכבשה בזן התרכיב ובזן השדה (11). במקרים בודדים מאד, ניתן היה להוכיח העברה אופקית של הזן בשדה (12). תוצאות אלה העלו שאלות בדבר יעילות ובטיחות החיסון, אך מענה לא היה לכך. במקביל, בודד והוגדר בישראל זן שדה בעל תכונות בקטריולוגיות דומות לאלו של זן התרכיב ונוצר קושי בהבנת המפה האפידמיולוגית (13). אפיון החיידק נעשה בשיטות ביוכימיות ע"י בדיקת צמיחת החיידק על פלטות אגר Tryptic soy המכילות צבעים פוקסין או טיונין, פליטתCO2, שחרור H2S, או פעילות אוראז. זן 19 נבדל מזן שדה ברגישות לפניצילין ולאריתריטול ולכן ניתן להגדיר את זן הבידוד באופן מדויק. בנוסף, ניתן לעשות הגדרת המין (species) באמצעות רגישות הזן לפאג’.
לאחרונה מתרבים הדיווחים על אפיון ברוצלה בשטת ה- PRC (14). שטה זו מאפשרת כיום לאפיין ברוצלה לפי מין וביוטיפ וכן לאפיין בידוד זן 19 (16, 15) או זן – RB51 (17). במעבדתנו מצוי הידע למבחנים אלה ואף פרסמנו שיטה המבדילה בין זן Rev.1 לבין זנים מקומיים (18). בשיטה זו הצלחנו להוכיח כי זן השדה בעל התכונות הדומה לזן התרכיב נוצר בעקבות מוטציה של זן מקומי ולא של זן התרכיב. באופן דומה, שיטת PCR המבוססת על זיהוי IS711 פותחה לגבי זן החיסון RB51 (19, 17).
הגדרת הבעיה ומטרות המחקר
לאור האמור למעלה הבעיה הניצבת בפני השרותים הוטרינרים הינה רבת פנים, כדלקמן:
• זיהוי מבדיל ברמה מולקולרית בין זני ברוצלה על בסיס המין והביוטיפ.
• זיהוי מבדיל ברמה מולקולרית בין זני חיסון וזני שדה.
• איתור וזיהוי ארועים של מחלה כתוצאה מהדבקה בזן תרכיב.
• איתור וזיהוי של חדירה אפשרית לישראל של פרות שחוסנו בארץ המוצא עם זן RB51.
• זיהוי ארועי ברוצלוזיס ללא בידוד הזן.
המחקר לפיכך יועד לפתח שיטות אבחון על בסיס הגברת DNA בשיטת ה – PCR וחיתוך באנזימי הגבלה בשימוש בזנים מוכרים להגדרת תבניות מולקולריות מבוססות. פיתוח השיטה אפשר שילובה בעבודת המעבדה כעזר לאבחון מהיר של ארועי ברוצלוזיס בשדה ומתן מענה שלטוני לבעיה בזמן אמת. זנים מארועים אפידמיולוגיים חשובים יובשו על ידי ייבוש בהקפאה ובכך תרמנו ליצירת אוסף ארצי ייחודי בעולם של בידודי זן תרכיב אבורטוס ומליטנזיס ושל זנים אלימים של ברוצלה מליטנזיס.
שיטות וחומרים
זני ברוצלה והפקת DNA: במעבדתנו אוסף נכבד של זני ברוצלה, זני ייחוס ברמה הטקסונומית. בשנות פעילות המעבדה אספנו בידודי שדה ובידודי אדם, כולל זני תרכיב מבידוד שדה. בעקבות מימון המחקר נתאפשר לנו לייבש בהקפאה את מרבית הזנים שנאספו ובכך ליצור מאגר ייחודי של זני ברוצלה שנאספו בארץ ולשמרם כבנק זנים בהקפאה עמוקה (-70oC). הזנים שוחזרו מחדש בצמיחה על פלטת אגר לברוצלה והחיידקים נאספו בתרחיף בתמיסת מלח פיסיולוגית. התרחיף שימש לניקוי ה- DNA הגנומי שהוכנס לתגובת ההגברה ב – PCR.
הגברת DNA בשטת PCR: DNA מנוקה שימש מצע להגברה. תגובת ההגברה נעשתה לגבי כל גן בנפרד, בשימוש בתחלים ובתנאים המצוינים באחד מהמאמרים .
(Cloeckaert et al., 1995 (Ref. No. 14
(Sangari et al., 1994a (Ref. No.15
(Sangari et al., 1994b (Ref No.16
(Briker and Halling, 1995 (Ref. No.17
(Bardenstein et al., 2002 (Ref. No.18
(Adone et al. 2001 (Ref. No.19
שימוש באנזימי הגבלה נעשה לפי הוראות היצרן.
התכנית לשנה הראשונה
בשנה הראשונה יצרנו את התשתית הניסויית. השתמשנו באוסף של זני ייחוס של הברוצלה ממינים וביוטיפים שונים: ברוצלה מליטנזיס זן 16M, זן תרכיב Rev.1, זן Ether ביוטיפ 3. ברוצלה אבורטוס זן 544, זן 2308, זן תרכיב S19, זן תרכיב RB51, זן Tulya ביוטיפ 3, ברוצלה סויס זן תרכיב S2 וברוצלה קניס. בדקנו יישום השיטות לגבי כל אחד מהזנים ומיסדנו תקן של תוצרי ההגברה הצפויים מהשיטה, כפי שמובא בטבלה 1.
התכנית לשנה השניה
בשנה השניה השלמנו את יישום השיטות בשימוש בזני ברוצלה של ייחוס כמו גם החלה של השיטות לגבי בידודים ישראלים המצויים בידינו. בנוסף, הפעלנו את תקן הבדיקות כפי שיסדנו בשנה הראשונה בכדי לתת תשובה בזמן אמת לשרותים הוטרינרים שנצרכו לקבל החלטות לגבי מדיניות ביעור והשמדה של המחלה בעדרי צאן של המועדון כמו גם בארועים של חדירת המחלה לרפת בקר לחלב.
תוצאות
קביעת מין הברוצלה בשלבים ראשונים של אבחון מחלה בצאן ובבקר חיונית לשרותים הוטרינרים להפעלת תכנית ביעור מושכלת. ברוצלה אבורטוס בוערה בישראל בשנות השמונים ולפיכך, זיהוי של חדירה מחדש, קרוב לזמן ההתפרצות, יאפשר סיכול ההתפשטות של המחלה בעדרים. באופן דומה, אבחון של חדירת ברוצלה מליטנזיס לפרות לחלב חיוני למניעת התפשטות המחלה לבני אדם. הגדרת הזן ברמה של הפרדה בין זן תרכיב (בשימוש השרותים הוטרינרים) לבין זן שדה חיונית להפעלה מהירה של תכנית ביעור במשק החולה למניעת התפשטות המחלה לעדרים נוספים כמו גם, להגנת התושבים מפני פיזור ברוצלה במוצרי חלב. השתמשנו בשיטות PCR שונות כדי לבסס תבנית של עבודה במעבדה להשגת תוצאות אבחון מולקולריות של גורם המחלה בעדר בשלבים הראשונים לזיהוי ההתפרצות במשק. טבלה מספר 1 מסכמת השיטות המולקולריות שנבדקו, גודל תוצר ההגברה המצופה ודרך השיפוט להבדלה בין זני שדה לזני תרכיב חיים.
בבניית תבנית שימוש קבועה של השיטות, מצאנו כי שיטת AMOS או זו של הגברת הגן omp2 יחד עם עיכול תוצרי ההגברה באנזימי ההגבלה המתאימים מאפשרת זיהוי מהיר וסגולי של מין הברוצלה. שיטת AMOS, כשמה, מיועדת להגדיר זני אבורטוס, מליטנזיס, אוויס וסוויס על פי גודל מוצר ההגברה (טבלה 1). בדומה, הגברת הגן omp2a מייצרת מקטע DNA בגודל שונה בין ברוצלה מליטנזיס לבין ברוצלה אבורטוס, ביוטיפ 1 (טבלה 1). בנוסף, חיתוך מוצרי ההגברה באנזימי הגבלה שונים מאפשר מחד להבדיל בין ברוצלה מליטנזיס זן תרכיב Rev.1 לבין יתר זני השדה, כולל זנים רגישים לפניצילין וצבעים ומאידך, זיהוי של ברוצלה קניס וסוויס. במחקר אחר שפרסמנו לאחרונה, יישמנו הבדלים אלה לפיתוח שיטה ייחודית לזיהוי זן החיסון Rev.1 (13).
Sangari ושות’ הראו כי ניתן לזהות זן תרכיב אבורטוס S19 על בסיס מוטצית חסר בגן המאפשר מטבוליזם של אריטריתול. לפיכך, בעוד זני אבורטוס טבעיים מייצרים פס הגברה בגודל 1063 זוגות בסיסים זה של S19 הנו קטן יותר, בגודל של 361 זוגות בסיסים, בלבד (טבלה 1). מענין לציין כי ההגברה של זן התרכיב RB51 ושל זן האם 2308 זהה לאלו של זן אבורטוס אלים. לפיכך, ניתן להבחין בשיטה זו בין זן חיסון 19 לבין זן RB51. השתמשנו בזני החיסון המסחריים מול זן ברוצלה אבורטוס לבדיקת התכנות השיטה במעבדתינו והוכחנו את יעילותה.
Adone ושות’ ו – Briker ושות’ פרסמו שיטה מבדילה לזיהוי של זן תרכיב אבורטוס RB51על בסיס מוטצית החדרה של רצף IS711 בגן המקדד לשרשרת הפוליסכרידית . מוטציה זו הינה הגורם למבנה מחוספס (rough) בזן RB51. לפיכך, בעוד בזני אבורטוס מתקבל פס הגברה בגודל 400 זוגות בסיסים, זה של זן RB51 הינו גדול יותר (בערך 1300 זוגות בסיסים, טבלה 1). שיטה זו מאפשרת זיהוי זן תרכיב אבורטוס RB51באופן ייחודי. היות ובישראל התקבלו מידי פעם בידודים של ברוצלה מליטנזיס במבנה מחוספס (rough) נוצר צורך לבדוק אם השיטה מבדילה גם בין אבורטוס RB51 מחוספס לבין יתר הזנים ממינים שונים שהם במבנה מחוספס, כמו גם קניס. ואכן, בדקנו השיטה והראינו שהיא מזהה באופן בלעדי את זן התרכיב RB51 לעומת יתר זני הברוצלה במבנה מחוספס.
אחרי שהראינו התכנות השימוש בשיטות ה – PCR השונות בא שלב מימושן בעבודת המעבדה. התקבלו במעבדתנו בידודים של זני ברוצלה שהוגדרו בשיטות בקטריולוגיות כברוצלה אבורטוס זן תרכיב 19. באחד המקרים, הבידודים התקבלו מכבשים מעדר מועדון. היות וחיסון כבשים לא נעשה בזן 19, הועלה הספק לגבי רמת הזיהוי של הזן במעבדה ונדרשה בדיקה נוספת לאימות התוצאה. במקרה אחר, בעדר פרות לחלב התקבלו בידודי ברוצלה משלוש פרות, אחד שהוגדר בקטריולוגית כזן חיסון 19 והשניים האחרים כברוצלה מליטנזיס ביוטיפ 2 (אנטיגניות אבורטוס). גם כאן, נדרשה בדיקה נוספת לאימות האבחון כדי לדעת אם ברוצלה מליטנזיס אכן חדרה לעדר. בשני המקרים הפעלנו את שיטת AMOS להגדרת המין, ואח"כ, הפעלנו את שיטת Sangari ושות’, לזיהוי זן התרכיב 19 והבדיקות אכן אששו את האבחון הבקטריולוגי. האופן שבו חדר זן תרכיב אבורטוס לכבשים אינו ברור לאשורו גם היום.
במקרה נוסף, השתמשנו בשיטת הגברת מקטע של הגן omp2 לאבחון ראשוני של שני ארועי ברוצלוזיס בצאן מחוסן, מהם בודד זן מליטנזיס לא טיפוסי, הרגיש לפניצילין ולצבעים. תכונות אלו מזכירות את זן התרכיב Rev.1, ולפיכך צריך היה לשלול האפשרות של מחלת הצאן בזן התרכיב. מתוצאות ה – PCR ניתן היה להסיק בוודאות, שההתפרצות במשק המחוסן היתה של זן שדה. משמעות הארוע לגבי ההגנה שהתרכיב מקנה לצאן צריכה להבחן לאור תוצאה זו.
דיון
השימוש בשיטת ה – PCR לאפיון מולקולרי של זן הבידוד, שיוכו למין הברוצלה ואפיונו כזן שדה או כזן תרכיב מזרז מתן תשובה לגבי גורם ההדבקה במשק המאובחן. באופן רגיל, לאחר הבידוד יש צורך לגדל החיידק בהעברות משניות בכדי לאפיינו על בסיס תכונות בקטריולוגיות. שיטת ה – PCR מאפשרת בדיקה מידית של מושבה או מושבות לאפיון מולקולרי באותו יום.
תוצאות המחקר הראו בוודאות שהבדיקות השונות הנן מהימנות. לא נמצאה סטיה אחת של התוצאות מן הצפוי. יותר מכך, בעת הפעלת המחקר, נבדקו בידודים שונים באופן משווה בבקטריולוגיה שגורה ובשיטת ה – PCR. תוצאות ה – PCR התאימו לחלוטין עם התוצאות הבקטריולוגיות. כך, הצלחנו להוכיח כי כבשים הודבקו בזן חיסון אבורטוס 19. כך גם הראינו כי אדם נגוע בחיידק לא מזוהה על בסיס בקטריולוגי הינו מהמין ברוצלה מליטנזיס שהשתנה למבנה מחוספס. לאחרונה, נתגלה עדר פרות לחלב כנגוע בברוצלוזיס. התקבלו דוגמאות משתי פרות חשודות שמהן צמחו מושבות של חיידקים. הזיהוי הבקטריולוגי של כל אחד מהבידודים הוביל לשתי הגדרות שונות, האחד הוגדר כברוצלה אבורטוס והשני כמליטנזיס. היות ויישמנו במחקר זה שיטת PCR המאפשרת זיהוי ברמת המין (AMOS) והבדלה בין זן חיסון (S19 or Rev.1), בהתאמה, בדקנו הבידודים שהתקבלו בשיטות אלו. התוצאות התקבלו בו ביום והוכיחו כי זן האבורטוס היה זן תרכיב S19 בעוד שהמליטנזיס היה זן שדה. בדיעבד, תוצאות אלו הוכחו גם בקטריולוגית. לפיכך, פיתוח ויישום האפיון המולקולרי על בסיס PCR שיפר השרות למגדלים ולשרותים הוטרינרים באופן משמעותי.
בנוסף לאמור, הצלחנו ליישם שיטת PCR המיועדת להגדרת זן התרכיב אבורטוס RB51. את הזן קבלנו מחברת Serum Colorado Company, יצרנית התרכיב. השיטה מראה בברור כי ניתן לאבחן זני ברוצלה במבנה מחוספס ולזהות ביניהם את הזן RB51. בהמשך, בכוונתנו לפתח שיטת Variable Number Tandem Repeats (VNTR) המזהה רצפים חוזרים במספר עותקים משתנה והמאפשרת יצירת קשר אפידמיולוגי של זנים שבודדו בנסיבות שונות. על בסיס שיטה זו, ננסה לקשר בין בידודים מארועים שונים ולייחס מקור הדבקה לארוע שאובחן.
תודה
החוקרים מבקשים להביע תודה לקרן הנהלת ענף בקר שאפשרה קידום מחקר זה. תודה גם לרופאי השרותים הוטרינרים שתרמו מזמנם ומכישוריהם להצלחת המחקר.
טבלה 1. עיצוב בדיקות PCR לזיהוי והגדרה של זני ברוצלה בישראל
# נתונים נבדקו לגבי ברוצלה מליטנזיס זן ייחוס B115
& פורסם על ידי ברדנשטין ס. ושות’
^ נתונים נאספו לגבי מספר זנים, כולם נתנו אותה תבנית
References

1. Alton, G.G., Jones, L.M., Angus, R.D., and Verger, J.M. (eds.). 1988. Techniques for the brucellosis laboratory. Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), Paris.

2. Madkour, M.M. 1989. Brucellosis. Butterworths, London.

3. Cotton, W. E., Buck, J. M., and Smith, H. E. 1933. Efficacy and safety of abortion vaccines prepared from Brucella abortus strains of different degree of virulence. J. Agri. Res. 46: 291 – 326.

4. Thomas, E.L., Bracewell, C.D., and Corbel, M.J. 1981. Characterization of Brucella abortus strain 19 cultures isolated from vaccinated cattle. Vet. Rec. 108: 90 – 93.

5. Nielsen, K., and Duncan, J. R. 1988. Antibody isotype response in adult cattle vaccinated with Brucella abortus S19. Vet. Immunol. Immunopath. 19: 205 – 214.

6. Schurig, G.G., Roop, R.M., Bagchi, T., Boyle, S., Buhrman, D., and Srianganathan, N. 1991. Biological properties of RB51; a stable rough strain of Brucella abortus. Vet. Microbiol. 28: 171-188.

7. Technical Committee for Vaccine Evaluation. 1997. Technical report on vaccination of cattle with Brucella abortus strain RB51. USDA/ARS/NADC, Ames.

8. Davidson, M., Shimshony, A., Adler, H., Banai, M., and Cohen, A. 1990. Protection of Brucellosis-free areas from reinfection. In: Advanceas in Brucellosis Research, Adams, L.G. (ed.) pp. 407-42 Texas A&M University Press, College Station.

9. Dafni, I., Hoida, G., Feinhaken, D., and Banai, M. 1989. Eradication of bovine brucellosis in Israel, 1970-1987. Israel J. Vet. Med. 45: 233-240.

10. Dafni, I., Hoida, G., Feinhaken, D., and Banai, M. 1990. Observation on Brucella melitensis infection in Israeli cattle herds. Israel J. Vet. Med. 46: 13-19

11. Banai, M. 1997. The Israeli experience of field application of S19 and Rev.1 in: The development of new/improved Brucellosis vaccines: Report of a WHO Meeting. World Health Organization, Department of Communicable Disease Surveillance and Response, 11 - 12 December 1997. Geneva, Switzerland. WHO/EMC/ZD1/98.14.

12. Banai, M., Abramson, M., Mayer, I., Chechik, K., Hoida, G., Zamir, O., Bardenstein, S., Cohen, A. and Davidson, M. 1996. Problems associated with the persistence and possible horizontal transfer of Brucella melitensis Rev. 1 vaccine in connection with serological surveillance in Israel. In: FAO/WHO/OIE Round Table on the Use of Rev. 1 Vaccine in Small Ruminants and Cattle. CNEVA Alfort, France, 21-22 September 1995. Garin-Bastugi, B., and Benkirane, A. (eds.) pp. 69-76, CNEVA, Maison-Alfort, France.

13. Banai, M., Mayer, I. and Cohen, A. 1990. Isolation, identification, and characterization in Israel of Brucella melitensis biovar 1 atypical strains susceptible to dyes and penicillin, indicating the evolution of a new variant. J. Clin. Microbiol. 28: 1057-1059.

14. Cloeckaert, A., Verger, J.-M., Grayon, M., and Grepinet, O. 1995. Restriction site polymorphism of the genes encoding the major 25 kDa and 36 kDa outer membrane proteins of Brucella. Microbiol. 141: 2111-2121.
לכל המבזקים....
office@milk.org.il פקס: 972-3-9564766 טל: 972-3-9564750 דרך החורש 4 , ת"ד 97, יהוד 5647003
מופעל באמצעות מעוף - מגוון אפקט