השוואת הרגישות והסגוליות של שיטות מעבדה שונות לזיהוי אילוח בחיידקי הבוטוליזם
מ. שפר1, א. שטיינמן2, מ. באום1, ק. גרינברג1, נ. שפיגל2 ,ד. אלעד1.
1מחלקה לבקטריולוגיה. המכון הווטרינרי ע"ש קימרון. בית דגן 50250, ישראל.
2בית ספר לרפואה וטרינרית ע"ש קורט, האוניברסיטה העברית בירושלים.
תוכנית מחקר מס' 845-0259-04
בוטוליזם היא מחלה הנגרמת ע"י הרעלנים של החיידק Clostridium botulinum. היות וההרעלה נגרמת על ידי הרעלנים, נחשבת מציאתם כ-gold standard לאבחון המחלה. שיטות האבחון הקיימות היום הן לעתים קרובות בעלות רגישות נמוכה מדי לזיהוי הרעלנים ולכן מקובלת בדיקת נוכחות חיידקי C. botulinum. היות והועלתה אפשרות שפרות יכולות להיות נשאיות של נבגים ולכן תתקבלנה תוצאות “False positive” בבדיקה הבקטריולוגית יש חשיבות רבה למאבחנים ורופאים וטרינרים לקבל נתונים על שכיחות מצב הנשאות במערכת העיכול של פרות בארץ.

מטרת המחקר הייתה לענות על השאלה האם פרות הן נשאיות של חיידקי Clostridium botulinum תוך שימוש בשיטות אבחון ביולוגיות.

במסגרת הניסוי נבדקו צואות מ 280 פרות ממשקים שעברו אירוע הרעלה וכאלו שלא חוו אותו. הדיגום כלל 20 פרות ממשקים מושביים שעברו אירועי בוטוליזם בעבר (בשנה 2002). כקבוצת היקש שימשו 10 פרות מאותו מושב אך ממשקים בהם לא נצפתה המחלה (על פי הנתונים בשו"ט). שאר הדוגמאות, 250 פרות, היו מ-2 משקים שיתופיים. דוגמאות צואה נבדקו בתרביות בשיטת הצברים (pool): 5 צואות בכל צבר. במקביל נבדקו צואות מ-7 פרות רובצות בשני משקים בזמן התפרצות המחלה.

כל דוגמאות הצואה, הן ממשקים שחוו התפרצויות בעבר והן אלה שלא חוו התפרצויות, היו שלילות במבחן ביולוגי . החומר היחיד שגרם לתמותה בעכברים ונוטרל על ידי אנטיסרום CDC מטיפוס D היה ממקרים בהם נצפו סימנים קלינים של הרעלת בוטוליזם.

סיכום עבודה היא שמצב נשאות של נבגי Clostridium botulinum במערכת העיכול של פרות בישראל הוא ככל הנראה אירוע נדיר ובידוד החיידק מחיות חשודות הוא בעל משמעות אבחונית.

Analysis of fecal samples from the Israeli cattle for presence of Clostridium botulinum
Marcelo Chaffer, Miriam Baun, Kalia Grinberg and Daniel Elad.
Department of Bacteriology, Kimron Veterinary Institute, Bet Dagan 50250, Israel.

The veterinary literature is controversial regarding the diagnostic significance of the presence of live cultures of Clostridium botulinum in the feces of cattle. Our study aimed at assessing the prevalence of a carrier state by analyzing fecal samples from the Israeli cattle for clinical manifestation of botulism in mice.
Two hundred and eighty feces samples were collected from farms that were either diagnosed with botulism (clinically and by the isolation of toxigenic Clostridium botulinum) in the past or those that had no records of the disease. All the samples were analyzed for the presence of clinically significant Clostridium botulinum organisms by inoculating mice as biological probes with bacteriologically enriched cultures. All samples, from farms that suffered from botulism outbreaks or, those that did not, were negative for toxin presence in the bioassay. According to our findings, toxigenic Clostridium botulinum is not carried in the feces of healthy cows.
השוואת הרגישות והסגוליות של שיטות מעבדה שונות לזיהוי אילוח בחיידקי הבוטוליזם.

מ. שפר, מ. באום, ק. גרינברג וד. אלעד.
מחלקה לבקטריולוגיה. המכון הווטרינרי ע"ש קימרון. בת דגן 50250, ישראל.
מבוא ורקע מדעי
בוטוליזם היא מחלה הנגרמת ע"י רעלני החיידק Clostridium botulinum .
חיידקים אלו הם מתגים אנאארובים, יוצרי נבגים אליפטיים רחבים הממוקמים לקראת סוף התא. נבגי חיידקי ה C. botulinum נמצאים במערכת העיכול של חיות שונות ובסביבה המזוהמת בצואתם.
חיידקי ה-C. botulinum מחולקים ל-6 טיפוסים על פי הרעלן שהם מייצרים המסומן באותיות A-F. טיפוס נוסף,המכונה G, מסווג כיום
כ-C. argentinense. (Bibertein & Hirsh, 1999)
במעלי גרה ההרעלות נגרמות על ידי טיפוסים C, B ו-D. המקורות העיקריים להרעלת בוטוליזם הם פגרים במזון והזנה בזבל עופות. בזבל עופות שעובר תהליך החמצה הרעלנים אמורים להיהרס. ההתפרצות מתרחשת כאשר הפרות אוכלות את המזון עם נבגים, חיידקים או הרעלן, כפי שפורסם בכמה עבודות. (Jean, et al., 1995; Galey et al., 2000, Kelch et al, 2000) .
במעלי גרה המחלה מתבטאת בחוסר שיווי משקל, קשיי נשימה, ובהמשך חוסר יכולת לעמוד ושיתוק הזנב . בהרעלות מרעלן B יש גם ריור חזק
(Elad, 2001).
האבחון האמין ביותר הוא מציאת הרעלן בנסיוב החולה או בתכולת מערכת העיכול שלו. במכון הוטרינרי מזון חשוד, כגון: תחמיץ ותערובת, נבדק רק לאחר אימות האבחון בפרות, על מנת לאתר את מקור ההרעלה. היות ולא תמיד ניתן למצוא את הרעלן בחומרים אלה, אולי עקב היותו קשור לרקמות העצבים, יש צורך לבצע תרביות לבידוד חיידקים טוקסיגניים שבמשך חמישה ימים מייצרים רעלן. לשם כך מסרכזים את התרביות ומזריקים את הנוזל העליון לעכברים. במידה ויש רעלן בתרביות, מופיעים בעכבר תחילה, קשיי נשימה המתבטאים בנשימה ביטנית והופעת "מותן דבורה" כתוצאה מכך ובהמשך, תמותה.
לאימות האבחנה והגדרת הרעלן, מטפלים בתרביות באנטיטוקסינים ספציפיים. סוג האנטיטוקסין אשר מונע את תמותת העכברים יזהה את הרעלן. תהליך אבחון (Bioassay) המחלה כולל: א. תרבית, ב. הזרקה לעכברים, ג. נטרול והזרקה נוספת. זהו תהליך ארוך שנמשך כ 13 יום
נשאלת השאלה האם ישנו קשר בין הימצאות החיידק והרעלן ובין הופעת סימני המחלה וזאת, משום שאת החיידק נתן לזהות גם בבהמות בריאות. מכאן קיימת אפשרות, שפרות יכולות להיות נשאיות של נבגים או חיידקים המתבטאת בתוצאות “False positive” במבחן הביולוגי.
במחקר שנעשה בשבדיה על 60 פרות מבית מטבחיים נמצא ש 73% של הדוגמאות היו חיוביות ל Non-proteolitic Clostridium botulinum type B ופחות מ 5% היו חיוביות ל Type F ו Type E. הבדיקות נעשו ע"י שיטה PCR
(Dahlenborg et al., 2003). במחקר שנערך ע"י אותם חוקרים
(Dahlenborg et al., 2001) נמצאו גם נבגים בצואות של חזירים.
לאור זאת, קיימת חשיבות רבה לדעת לגבי רגישות וסגוליות של השיטה הביולוגית ולקבל נתונים עד כמה פרות יכולות לשאת את החיידקים במערכת העיכול.
מטרת המחקר
לבדוק האם פרות בריאות ממשקים שעברו אירוע הרעלה בוטוליזם וכאלו שלא חוו אותו הן נשאיות של חיידקי Clostridium botulinum וזאת תוך שימוש בשיטות אבחון ביולוגיות.
חומרים ושיטות
מערכת תרביות
דוגמאות צואה מפרות במשקים שנבדקו נזרעו על מצע
Fortified Egg Medium (FEM) המכיל בעיקר בשר בקר, חלבון ביצים, וגלוקוזה ע"פ Senger et al (1971). התרביות הודגרו במשך 5 ימים ב 33 מ"צ בתנאים אנארובים.

מבחן ביולוגי
הדוגמאות נבדקו השיטה הביולוגית בעכברים המשמשת כ-gold standard לזיהוי נוכחות חיידקי C. botulinum טוקסיגנים. לאחר 5 ימי הדגרה, תרביות הצואה עברו סרכוז במשך 20 דקות בצנטריפוגה במהירות של 8000 RPM והנוזל עליון הוזרק לעכברים. הבדיקה כללה 2 עכברים לדוגמה. כל עכבר קבל 1 סמ"ק של הנוזל העליון. במקרה של מוות בעכברים נערך מבחן סתירה על ידי נוגדנים מונו-ספציפיים, אנטיסרום CDC ,על מנת לאבחן איזה סוג של רעלן גורם למות העכברים.

פרות
במסגרת הניסוי נבדקו צואות מ 280 פרות ממשקים שעברו אירוע הרעלה וכאלו שלא חוו אותו. הדיגום כלל 20 פרות מעל גיל 4 שנים, ממשקים מושביים שעברו אירועי בוטוליזם בעבר (בשנה 2002) ו-10 פרות באותו גיל, מאותו מושב. פרות ממשקים בהם לא נצפתה המחלה (על פי הנתונים בשו"ט) שמשו כהיקש. שאר הדוגמאות, 250 פרות, היו מ-2 משקים שיתופיים שלא היו חולים בעבר. דוגמאות הצואה נבדקו בתרביות בשיטת הצברים (pool): 5 צואות בכל צבר. במקביל נבדקו צואות מ-7 פרות רובצות בשני משקים בזמן התפרצות המחלה.
תוצאות
כל דוגמאות הצואה שתורבתו בצורה בודדת או צבר, הן ממשקים שחוו התפרצויות בעבר והן אלה שלא, מפרות בריאות, נמצאו שליליות במבחן הביולוגי (טבלה 1) .
החומר היחיד שגרם לתמותה בעכברים ונוטרל על ידי אנטיסרום מטיפוס D מה CDC, מקורו ב 7 פרות הביקורת החיובית ממקרה שדה, שאובחנו קלינית כחולות במחלת הבוטוליזם, כאשר המבחן הביולוגי אישר האבחון בשדהת שמבוסס על סימנים קלינים.
טבלה 1 - תוצאות המבחן הביולוגי לבוטוליזם
משק מקרים המחלה בעבר תרביות צואה סימני מחלה מספר פרות שנבדקו תוצאה במבחן הביוליגי
מושבי א כן בודדת אין 20 שלילית
מושבי ב לא בודדת אין 10 שלילית
שיתופי א לא צבר אין 125 שלילית
שיתופי ב לא צבר אין 125 שלילית
מושבי ג התפרצות במשק בודדת סימנים קליניים 5 חיובית לבוטוליזם מטיפוס D
שיתופי ג התפרצות במשק בודדת סימנים קליניים 2 חיובית לבוטוליזם מטיפוס D
דיון
בעבודה שלנו נבדקו כ 280 פרות לנוכחות חיידקי בוטוליזם במערכת העיכול ,ללא תוצאות חיוביות.
לעומת זאת, במחקר שנעשה בשבדיה מצאו החוקרים
(Dahlenborg et al., 2003) פרות מבית מטבחיים חיוביות ל Non-proteolitic Clostridium botulinum type B בשיטת ה PCR.
ההבדלים בהוצאותינו המראות רמת נשאות נמוכה מאד בישראל לבין אלה של החוקרים הנ"ל יכולים להיות תוצאה של מספר גורמים כגון טמפרטורה (מזג-אוויר), סוג קרקע והמזון הניתן לפרות.
חשוב גם לציין שבעבודה של Dahlenborg et al., 2003 עבדו החוקרים בשיטת ה- PCR בזמן שבעבודה שלנו נעשה שימוש במבחן הביולוגי.
התאמה מלאה הייתה בשבע פרות שהראו סימנים קליניים עצביים, אובחנו קלינית כמקרה בוטוליזם ונבדקה נוכחות של חיידקים שמייצרים רעלן במערכת העיכול של הפרות. בכל הפרות הבריאות לא נמצאה נוכחות של חיידקי Clostridium botulinum בוטוליזם במערכת העיכול.
ביבליוגרפיה

Bibertein, E.L. and Hirsh D.C. The Clostridia. (1999) In: Veterinary Microbiology, Ed: Hirsh D.C. and Zee, Y.Ch. Blackwell Science.

Dahlenborg M., Borch, E and Radstrom P. (2001). Development of a Combined Selection and Enrichment PCR Procedure for Clostridium botulinum Types B, E, and F and Its Use To Determine Prevalence in Fecal Samples from Slaughtered Pigs. Appl. Envir. Microbiology 67:4781-4788.

Dahlenborg M., Borch, E and Radstrom P. (2003). Prevalence of Clostridum botulinum types B, E and F in faecal samples from Swedish cattle. Int. J. Food Microbiol. 25:105-110.

Elad, D. (2001) Bacteriology Course. Koret School of Veterinary Medicine. Hebrew University of Jerusalem. http://agri3.huji.ac.il/~eladd/

Galey, F.D., Terra, R., Walker, R., Adaska, J., Etchebarne, M.A.., Puschner, B., Fisher, E., Whitlock, R.H., Rocke, T., Willoughby, D. and Tor, E. (2000). Type C botulism in dairy cattle from feed contaminated with a dead cat.
J. Vet, Diagn. Invest 12:204-209.

Jean, D., Fecteau, G., Scott, D., Higgins R, Quessy, S. (1995). Clostridium botulinum type C intoxication in feedlot steers being fed ensiled poultry litter. Can Vet. J. 36:626.

Kelch, W.J., L.A. Kerr, J.K. Pringle, B.W. Rohrbach and R.H. Whitlock. 2000. Fatal Clostridium botulinum toxicosis in eleven Holstein cattle fed round bale barley haylage. J. Vet. Diagn. Invest. 12:453.

Segner, W.P., Schmid, C.F. and Boltz, J.K. (1971). Enrichment, isolation and cultural characteristics of marine strains of Clostridium botulinum type C. J. of Applied Microbiol. 34:1017-1024
לכל המבזקים....
office@milk.org.il פקס: 972-3-9564766 טל: 972-3-9564750 דרך החורש 4 , ת"ד 97, יהוד 5647003
מופעל באמצעות מעוף - מגוון אפקט