תוכנית מחקר מס' 851-0328-07


אפיון מולקולרי של זני בבזיה בוביס המשמשים ליצור תרכיבים והשוואת זני תרכיב לזני שדה אלימים

 

ד"ר מוניקה מזוז

תקציר
מחלת בבזיוזיס הנגרמת על ידי טפיל ב.בוביס מסבה נזקים כלכליים כבדים למשק בקר. בישראל נהוג לחסן בקר נגד בבזיוזיס בתרכיב המכיל טפילים חיים מוחלשים. להבדלה בין זני שדה אלימים לבין זן חיסון נעשה שימוש בסמן גנטי של גן BV80הקיים כעותק יחיד בגנום של ב.בוביס. לגן מבנה ייחודי, הוא מורכב מאזור משתנה התחום משני צידיו באזורים שמורים. האזור המשתנה ((Hypervariable מכיל מספר לא קבוע של מקטעים חוזרים, דבר המאפשר הבדלה בין הזנים של ב.בוביס. בעבודה הנוכחית נבדקו הזנים הישראלים המשמשים לחיסון בקר וזנים שבודדו ממספר התפרצויות בשדה, לנוכחות המקטעים החוזרים כמו כן נבדק יציבותו של הגן BV80 בזני התרכיב במהלך החלשת האלימות של הטפילים. הבדיקות בוצעו על ידי הגברת המקטע המשתנה של הגן בPCR, שיבוט ופענוח הרצף של המקטע המשובט. הגברת המקטע של הגן מבידודים שונים הניב מקטע בעל 450-850 בסיסים. בהמשך התברר שזן תרכיב מכיל לפחות שלושה רצפים שונים של הגן, מתוכם רצף דנ"א אחד נמצא גם באחד מבידודי שדה. נמצאה זהות גבוהה במקטעים של הגן שהוגברו ב PCRעם תבנית הDNA שהופק מב.בוביס מזן חיסון במהלך תהליך החלשתו על ידי העברות בעגלים. מספר המקטעים החוזרים בין הזנים נע בין 11 ל28. הקבלה בין מספר החזרות לבין האלימות או מקור הזנים טרם נמצאה. המצאות של רצפים שונים מעידה על אוכלוסיה בלתי אחידה של טפילים באותם הזנים. הימצאות של תת-אוכלוסיות וחוסר היציבות של האזור הווריאבילי בגן BV80 בתוך הזן עצמו וגם בזני תרכיב לאחר עשרות העברות בבקר במהלך החלשה לא מאפשר הבדלה בין זני תרכיב וזני שדה.


1. מבוא
בבזיה ביגמינה וב. בוביס הינם טפילים חד תאיים הגורמים למחלת בבזיוזיס בבקר. המחלה מהווה מכשול והכבדה על טיפוח וגידול בקר בישראל ובאזורים טרופיים וסובטרופיים בעולם בכלל ( McCosker; 1981, Pipano and Hadani;1984) חיסון הבקר, עם טפילים ממויירים, היא השיטה היעילה ביותר להדברת המחלה (DeVos and Jorgensen; 1996, Pipano;1995, Bock et al; 2004)
אפיון מולקולרי של זני בבזיה בוביס המשמשים ליצור תרכיבים והשוואתם לזני שדה אלימים הינו כלי חשוב ביותר על מנת להבין ולברר סיבות אפשרויות להתפרצויות של בבזיוזיס בקרב בקר מחוסן. הגן BV80 קיים כעותק יחיד בגנום של ב.בוביס (Hines et al., 1995) הגן מקודד לחלבון מבני המכונה Sbp1 ( (Spherical body proteinהמרכיב את אחד האברונים של ב.בוביס 06החלבון בעל גודל של 77-80 kDa (Tetzlaff et al., 1992, Brown 1993). הגן מכיל אזורים שמורים המופרדים על ידי מקטעים חוזרים (tandem repeats) בעלי רצף ואורך שונים (Darlymple et al., 1993), האזור המשתנה ((Hypervariable מכיל מספר לא קבוע של מקטעים חוזרים, דבר המאפשר הבדלה בין הזנים של ב.בוביס. השוואת רצף דנ"א של הגןBV80 בין בידודים רחוקים מבחינה גיאוגרפית הראו שבאזור השמור כול הבידודים מכילים קבוצה של 13-15 ""serine ברצף באזור שמקדים את האזור המשתנה. הודות למאפיינים אלה הגברת הגן BV80 בPCR, עם תחלים שמקיפים את האזור המשתנה, משמש ככלי להבדלה בין זנים שונים של ב. בוביס  (Lew et al., 1997a,b).
בעבודה הנוכחית בדקנו את האפשרות להבדיל בין זנים של ב.בוביס על ידי PCR של הגן BV80, RT-PCR ופענוח רצף דנ"א של תוצרי הPCR. כמו כן אפיון מולקולרי של הגן 80BV נעשה בזנים ישראלים שבודדו מהשדה, ובזני התרכיב. בנוסף לכך כדי לבדוק את יציבות הגן בתהליך החלשת הזן נבדק רצף דנ"א שהתקבל בריאקציה PCR של הזן GON במהלך העברות בעגלים המשמשים לייצור התרכיבים.


2. מטרות
1. לאפיין את הגן BV80 בזני בבזיה בוביס הישראלים המשמשים לתרכיב ובידודים מהשדה בעזרת PCR ופענוח רצף דנ"א.
2. ליישם את השיטת הPCR להבדלה בין זני תרכיב הן מדם תורם והן מתרבית ובידודים מהשדה
3. לבדוק יציבות הסמן הגנטי של זני התרכיב במשך העברות בעגלים המשמשים לייצור התרכיבים.


3. חומרים, תהליכי ושיטות עבודה
א) בקר- עגלים בני 3 חודשים ומעלה, מגזע הולסטיין לאחר נטילת טחול שמשו להפקת טפילים מזני תרכיב (T ו MH) וזני שדה (GAZ , KL,GON ו(GAL
ב) טפילים- מקור הטפילים הנו בזנים שונים של ב.בוביס.
    זני תרכיב: T ו MH הוחלשו בעבר ולעבודה הנוכחית הופקו מדם עגל מודבק או מתרבית של ב.בוביס.
    זני שדה: 4 בידודים מהתפרצויות קודמות (זנים GAZ, KL,GON וGAL)
ג) מבחני PCR הגברת הגןBV80 נעשה על ידי שני מבחני PCR:
   1) תחלים BV80f וBV80r לפי עבודתה של Lew et al; ((1997.
   2) תחלים TRf וTRr (על בסיס נתוני הרצף (GenBank accession number M99575
ד) הפקת RNA ומבחן RT-PCR
הפקת RNA נעשתה עם TriZol בהתאם להוראות היצרן ((Gibco-BRL ובהמשך שמש RNA
כתבנית להפקת cDNA בשטת RT-PCR
ה) רצף דנ"א: לבדיקת רצפים תוצרי הדנ"א מהPCR וRT-PCR נוקו מאנזימים ושובטו בפלסמיד pGEM -T -Easy. דנ"א מהפלסמיד המכיל את המקטע הרצוי נשלח לקביעת רצף שיאפשר השוואה בין הזנים השונים.


4. תוצאות:
בהגברת גןBV80 של טפילי ב. בוביס מוחלשים מזני תרכיב ובידודים אלימים מהשדה עם זוג תחלים BV80f ו BV80r שפורסמו בעבר ((Lew et al., 1997a,b. התקבלו מקטעים בעלי גדלים שונים בין 450 עד ל 800bp (תמונה מס' 1) . בזן תרכיב T הן ממקור תרבית והן מדם תורם ובזן תרכיב MH ממקור תרבית, הגברת הגן BV80 הניבה מקטע דומיננטי בגודל דומה ובנוסף התקבלו מקטעים קצרים יותר. לעומת זאת הגברת הגן 80BV מהזן MH מדם תורם הניבה תוצר בעל אורך השונה מזה שהתקבל מהטפילים שמקורם בתרבית (תמונה מס' 1 ערוצים 1-4). הגברת הדנ"א עם זוג תחלים אחרים TRf וTRr הניבה תוצאות מקבילות לתוצאות הקודמות (תמונה מס' 2) ניתן לראות שבזן שדה GON העברה 6 ו17 התקבלו מקטעים בגודל זהה (ערוצים7ו8 לפי הסדר). יש לציין שבשתי הריאקציות הוגבר ברוב הזנים מקטע דומיננטי מלווה במקטעים קצרים יותר בגודל דומה.
לאחר PCRנעשה שיבוט של תוצרי PCR, וקריאת רצף הדנ"א של המקטעים הדומיננטיים של זני ב.בוביס, בנוסף לכך גם המקטעים הקצרים יותר שהתקבלו מהגברת הגן 80 BV מדנ"א של טפילים ב.בוביס מזן תרכיב T מדם תורם, וזני שדה KL וGAZ שובטו בפלסמיד והרצף של המקטעים פוענח (תמונה מס' 3). מרצף דנ"א של הגןBV80 שפוענח נקבע רצף משוער של חומצות האמינו.
בהשוואת רצף משוער של חומצות האמינו, נמצא ש מספר חומצות אמינות נע בין 111 עד ל 179. בנוסף לכך בין בידודים השונים נמצא שכול הבידודים מכילים אזור שמור המקדים את האזור המשתנה ומכיל קבוצה של 13-14 ""serine ברצף. אזור משתנה הכיל בין 11 ל28 מקטעים חוזרים בני 4-5 חומצות אמינות. למרות השינויים בין זנים השונים, רצף דנ"א זהה התקבל מהגברה של הגן BV80 מזן תרכיב T מדם תורם (variant 1-2), זן תרכיב מתרבית T ((vcu , ובידודי שדה GAZ (variant 1-3) וKL (variant KL-6).
מרצף דנ"א שהתקבלו ממקטעים הקצרים יותר של זני תרכיב T מדם תורם, וזני שדהgaz ו KL נראה כי מדובר בתת-אוכלוסיות שקימות בתוך הזן אם כי כמותם פחותה יחסית לאוכלוסייה הדומיננטית.
על מנת לבדוק נוכחות של תת-אוכלוסיות ברמה של mRNA נעשתה בדיקת RT-PCR של בידוד שדה KL. מרצף דנ"א שהתקבל לאחר PCR ((KL-6 KL-7 וRT-PCR ( R8ו(R9 נמצא שרצף דנ"א של אוכלוסיית KL-6 זהה ל R8 ובאוכלוסיות R9 ו KL-7יש מספר שונה של מקטעים חוזרים.
החלשת זנים של ב. בוביס מתבצעת על ידי העברות מהירות של הטפילים בבקר נטול טחול או על ידי העברות בתרבית תאים. על מנת לעקוב לאחר שינויים בגן BV80 בתהליך החלשה של בידודי שדה, נבדק רצף דנ"א של הגן BV80 בזן תרכיב GON במהלך העברות 4, 6 ו 17 . יש לציין שעל ידי הזרקת טפילים מהעברת 13 לבקר רגיש נמצא שההחלשה תושגה בהעברה זו (תוצאות לא מוצגות בעבודה זו). אומנם רצף דנ"א של הגן בשלוש העברות היה כמעט זהה (עם זהות של 97%-עד %99), בעברה מס' 17 (variant 17A) נמצאו 16 מקטעים חוזרים לעומת 24 שנמצאו ברצפים של העברות 4 6 ו17 (variant 17B). יתכן וקריאת רצפים רבים נחוצה כדי לבדוק את כל האוכלוסיות הקיימות במהלך העברות ולקבוע באם variant 17A שנמצא בהעברה 17 מצביע על שינוי אוכלוסיות בתהליך ההחלשה או שאותה אוכלוסיה קיימת גם בעברות הנמוכות יותר.

תמונה מס' 1: הגברת הגן BV80 על ידי PCR עם התחלים BV80 F + BV80R ערוצים 1-9 לפי: (1 ) זן תרכיב T מתרבית, (2 ) זן תרכיב T מדם תורם, (3) זן תרכיב MH מתרבית, (4) זן תרכיב MH מדם תורם, (5) בידוד שדה GON העברה 17 (6) ביקורת שלילית (7) בידוד שדה  GAZ  8( בידוד שדה GAL  9( 1Kb Marker.

תמונה מס' 2: הגברת הגן BV80 על ידי PCR עם התחלים TRf+TRr ערוצים 1-8 לפי: 1( זן תרכיב T מדם תורם, 2) זן תרכיב MH מדם תורם, 3) זן אוזבקי, 4) בידוד שדה GAL, 5) בידוד שדה GAZ, 6) בידוד שדה GON העברה 6, 7) בידוד שדה GON העברה 17, 8( 1Kb Marker

 


תמונה מס' 3: רצף חומצות האמינו המשוערות שהתקבלו לאחר קריאת רצף דנ"א של הגן 80BV בזני תרכיב ובידודי שדה ישראליים.

 


5.דיון ומסקנות
הגברת הגן BV80 בזני תרכיב ובבידודי שדה נעשתה בשתי ריאקציות במקביל, והניבה בשתיהם מקטעים בעלי גדלים שונים הנעים בין 450 עד ל 800bp במספר זנים הגברת הגן BV80 של זן בודד הניבה יותר ממקטע אחד. לאור העובדה שהגן 80BV קיים כעותק יחיד בגנום (Hines et al; 1995), הופעת מקטעים נוספים בהגברה של זן יחיד מצביעה על נוכחות תת אוכלוסיות השונות זו מזו לפחות בגן הנבדק. ממצאים אלה תואמים מסקנות של עבודות קודמות לפיהן אוכלוסיה של ב. בוביס שמקורה בבע"ח בודד מכילה יותר מאוכלוסיה אחת בעלת שונות גנטית (Dalrymple et al;1992)
בהמשך העבודה, על ידי בדיקת רצף דנ"א של אותם מקטעים לאחר שיבוט אומתה ההנחה שמדובר בתת-אוכלוסיות בתוך זן בודד. בעבודה זו נצפה עד 3 תת- אוכלוסיות בזן בודד, ברור לנו שאוכלוסיות אלה הינם רק חלק מכלל תת-אוכלוסיות הקיימות בזן ורצפים רבים נחוצים על מנת לבדקם. חשוב לציין שגם בבדיקת RT-PCR הוגברו ופענחו רצף דנ"א של שתי אוכלוסיות שונות בזן שדה שבודד מבקר חולה.
בנוגע ליציבות הגן במהלך העברות בעגלים נמצאה זהות ברמה גבוהה במקטעים של הגן שהוגברו ב PCRעם תבנית הדנ"א שהופק מב.בוביס מזן GON בהעברות 4 6 ו17 במהלך תהליך החלשתו בעגלים. יחד עם זאת בהעברה 17 נמצאה תת אוכלוסיה המכילה מספר נמוך יותר של מקטעים חוזרים בהשווה לרצפים נוספים מאותה העברה ומהעברות נמוכות יותר. למרות שנבדקו מספר רצפים לכל ההעברות טרם התקבלו מסקנות לגבי קשר בין מספר העברות ושינויים באזור המשתנה. מעבודות שבוצו בעבר נראה שלמרות שבין הזנים קיימים ההבדלים באזור המשתנה של הגן BV80, המכיל אזורים המקודדים לאפיטופים של תאי T וB (Tetzlaff et al., 1992, Brown et al., 1993), ההבדלים האלה אינם מפחיתים תגובת נוגדנים בין הבידודים השונים (Hines et al., 1995). על פי ספרות מדעית נראה כי רוב השינויים ברצף הגן במהלך העברות בבע"ח או בתרבית הם כתוצאה מבירור של תת-אוכלוסיות סמויות שהיו קיימות טרם תהליך ההחלשה (Lew et al 1997) . מנתוני העבודה הנוכחית סביר להניח שבתוך הזנים שנבדקו קיים מספר רב של תת-אוכלוסיות בעלות אלימות שונה ויש לשער שבתהליך ההחלשה משתנה היחס בין תת אוכלוסיות כאשר תת אוכלוסיות בעלות אלימות נמוכה מהוות רוב בתוך הזן.


לסיכום:
1) הימצאות של אוכלוסיות רבות בתוך זן בודד ושל רצפים זהים בין זנים שונים, או רצפים שונים בין מקטעים בגודל זהה מאוד מקשים על יישום השיטה בהבדלה בין זנים.
2) טרם נמצאה הקבלה בין מספר החזרות לבין האלימות או מקור הזנים.
3) המצאות של רצפים שונים בזן יחיד או בתוך תאייים משובתים מעידה על אוכלוסיה בלתי אחידה של טפילים.
נראה איפה שיש להמשיך ולחקור גנים נוספים של ב. בוביס שיכלו לשמש סמנים להבדלה בין הזנים ואו סימנים לרמת האלימות של הזן.


6. רשימת ספרות

 

1. Bock R.E., Jackson L., DeVos A.J. and Jorgensen W. 2004. Babesiosis of cattle. Parasitol. 129: S247-S269.
2. Brown W., Zhao S., Woods V., Tripp C., Tetzlaff C., Heussler V., Dobbelaere D., Rice-Ficht A. 1993. Identification of two Th1 cell epitopes on the Babesia bovis encoded 77KDa merozoite protein by use of truncated recombinant fusion proteins. Infect. Immun.; 61: 236-244.
3. Dalrymple B., Peters J., Waltisbhul D., Goodger B., Buschel G., Wright I. 1993. Cloning and characterization of cDNA clones encoding two Babesia bovis with homologous amino and carboxy terminal domains. Mol. Biochem. Parasitol.; 59: 181-190.
4. Dalrymple B., Jorgesen W.K., Vos A.J. de and Wright I. G. 1992. Analyses of the composition of samples of Babesia bovis and the influence of different environmental conditions on genetically distinct subpopulations. Int. J.Parasitol.22:731-737.
5. DeVos A., and Jorgensen W.,1996. Bovine babesiosis. OIE manual of standards for diagnostic test and vaccines. Off. Int. Epizootol. Paris 333-338.
6. Hines S., Palmer G., Brown W., McElwain T., Suarez C., Vidotto O., Rice-Ficht A. 1995. Genetic and antigenic characterization of Babesia bovis merozoite spherical body protein Bb-1. Mol. Biochem. Parasitol.; 69:149-159.
7. Lew A., Bock R., Croft J., Minchin C., Kingston T. and Dalgliesh R. 1997(a). Genotypic diversity in field isolates of Babesia bovis from cattle with babesiosis after vaccination. Aus. Vet J.;75,8: 575-578.
8. Lew A.E., Dalrymple B., Jeston P., Bock R. 1997(b). PCR methods for discrimination of Babesia bovis isolates. Vet. Parasitol.; 71: 223-237.
9. McCosker P. 1981. The global importance of babesiosis. In: Babesiosis. Ed Ristic M. and Kreier J. Pp.1 New York, London, Toronto, Sydney, San Francisco, Academic press.
10. Pipano E. 1995. Live vaccines against hemoparasitic diseases in livestock. Vet. Parasitol.57: 213-231.
11. Pipano E. and Hadani A. 1984. Control of bovine babesiosis. In: Malaria And Babesiosis. M.Ristic, B. Ambrioise-Thomas & J.P. Krier (eds.), Martnus, Nijhoff, Netherlands., pp. 263-303.
12. Tetzlaff C., Rice-Ficht A., Woods M., Brown W. 1992. Induction of proliferative responses of T cells from Babesia bovis immune cattle with a recombinant 77 kDa protein (Bb-1). Infect. Immun.; 60: 644-652.
13. Tripp C., Wagner G. and Rice-Ficht A. 1989. Babesia bovis: gene isolation and characterization using a mung bean nuclease derived expression library. Exp. Parasitol.; 69: 211-225.

לכל המבזקים....
office@milk.org.il פקס: 972-3-9564766 טל: 972-3-9564750 דרך החורש 4 , ת"ד 97, יהוד 5647003
מופעל באמצעות מעוף - מגוון אפקט