טכניון-מכון טכנולוגי לישראל                                      פקולטה להנדסה אזרחית וסביבתית

 


מדידת איכות חלב בקו חליבה באמצעות ספקטרוסקופית FTIR בתחום ה- mid-infrared


מספר מנהל המחקר החקלאי 838-0512-05
מספר מועצת החלב 702937
מספרי טכניון 2005876 - 2005911


דוח מדעי סופי
מוגש ע"י
רפאל לינקר
יצחק שמולביץ


בעזרת
יעל עציון
אושרי ליבוביץ
מורן רוזנברג


חיפה, מרץ 2007

 

 

 


תוכן עניינים:


1. מבוא

2. מטרות המחקר
3. שיטות

    3.1. מהלך הדגימות
    3.2. מהלך המדידות
    3.3. התקני ATR למדידות ספקטראליות של חלב גולמי בתחום ה- Mid-infrared
4. אנליזה מתמטית

5. תוצאות

    5.1. מדידות באמצעות טבלן ATR
       5.1.1. חלבון
       5.1.2. לקטוז
       5.1.3. שומן

       5.1.4. רמות תאים סומטיים
    5.2. מדידות באמצעות התקן ATR זווית משתנה (זוויתן)
       5.2.1 חלבון
       5.2.2 לקטוז
       5.2.3. שומן
6. סיכום ומסקנות
7.ספרות

 

 

 


1. מבוא
מרכיב החלבון בחלב, בשילוב עם תכולת השומן, עם הרכב מינרלים ועם לקטוז, הינו גורם מכריע בטכנולוגיה של ייצור מוצרי חלב, המכוונת להשגת תכונות פונקציונאליות הכוללות: יכולת וניצולת הגבנה (curd formation), צמיגות, חוזק הקרשה ומאפייני טעם. בנוסף, יש למרכיבי החלב, במיוחד למרכיב הקזאין ולסידן, חשיבות תזונתית רבה. מהיבט ניהול העדר, הרכב החלב, ובמיוחד נוכחות תאים סומטים, מהווה סמן פוטנציאלי למצב הפיזיולוגי של הפרה (Emmons et al, 1990).
מסיבות אלו ישנה מוטיבציה עצומה לפתח שיטות שתאפשרנה לקבל נתוני הרכב חלב on-line וע"י כך לשפר בקרה ואופטימיזציה, הן לטובת ניהול העדר, והן לבקרת חומר הגלם לייצור מוצרי חלב.
בשנים האחרונות נעשה שימוש בקנה מידה תעשייתי בספקטרוסקופית FTIR לצורך מדידת מרכיבי חלבון, שומן, ולקטוז בחלב, ושימוש בספקטרוסקופיה פלואורסנטית, כשיטה משלימה למדידת תאים סומטיים בחלב.
ספקטרוסקופיית FTIR הינה שיטת מדידה אופטית המאפשרת לכמת מרכיבים בחלב על סמך בליעות של קרינה בתחום התת-אדום (Infrared – IR) האופייניות לאותם מרכיבים. לספקטרוסקופית ה-FTIR יתרונות רבים, כולל מהירות, דיוק ויכולת לכמת מספר מרכיבים במקביל על פי מדידה אחת, אלא שכיום מדובר על שיטה מעבדתית, המודדת דגימות חלב מרפתות, על בסיס חודשי. הסיבות המרכזיות לכך הן עלויות המכשור הקיים ואופן האינטראקציה בין הקרינה לחלב; היות והקרינה צריכה לעבור דרך החלב בדרך אופטית קבועה, נעשה שימוש בצנרת שאיבה לתוך תא דגימה שקוף לקרינת IR. על מנת למנוע סתימות מצנרת ע"י חלקיקי שומן (גלובולות) גדולים מופעלים על החלב מאמצי גזירה לצורך הימגון לפני השאיבה. התקן דגימה זה אינו ישים למדידות על קווי חליבה. טכניקת דגימה אחרת למדידות FTIR בתחום ה mid IRהינה ה-ATR : attenuated total reflectance. בשיטה זו הקרינה מודרכת דרך גביש בעל מקדם שבירה גבוה, שנמצא במגע עם החומר הנמדד. תוך כדי התקדמותה בגביש, הקרינה פוגעת בדופנותיו ומוחזרת מספר פעמים. בכל פגיעה והחזרה מתרחשת חדירה לתוך המדיום הנמצא בצמוד לגביש. עומק חדירת הקרינה (הדרך האופטית) תלוי בגיאומטריה של הגביש ובזווית כניסת הקרינה לגביש (איור 1). התקן מסוג ATR מאפשר מדידה בתוך החלב, ולכן עשוי להתאים למדידות בקווי חליבה. במחקר קודם (עציון 2004 ;Etzion et al., 2004) הצגנו יכולת לנבא תכולת חלבון ע"י מדידת אותות ספקטרליים של חלב גולמי על גביש ATR בתחום ה-mid IR (4000-1000cm-1) ושימוש בשיטות ניתוח רב משתני של אותות אלו. מחקר זה בוצע לדגימות חלב סטנדרטיות המשמשות לכיול מכשירי המעבדה המרכזית לחלב בקיסריה, על גבי משטח ATR אופקי. במסגרת המחקר הנוכחי נבדקה ישימות השיטה לדגימות חלב גולמי מפרות שונות, תוך סימולציה למדידה במדיום חלב בזרימה. לצורך כך נעשה שימוש בדוגם ATR הטובל בחלב גולמי, תוך כדי בחישה. בנוסף נערכו מדידות בדוגם ATR המאפשר שינוי בזוית החדירה של הקרינה לגביש ולדגימת החלב, על מנת לבדוק אפקטים של עומק חדירת הקרינה על ספקטרום הבליעה של חלב ועל היכולת להפיק ממנו אינפורמציה. הדגימה התבצעה בשלוש עונות עוקבות: קיץ 2005, חורף 2006 וקיץ 2006 ניתוח הנתונים והמודלים המוצגים במשך הדו"ח מתבססים על סה"כ על 180 דגימות מ-72 פרות ויותר מ-900 מדידות ATR.


2. מטרות המחקר:
מטרת המחקר הנוכחי הייתה לבחון את ישימות ספקטרוסקופית ה-ATR-FTIR לאנליזת חלב גולמי מפרות נפרדות, על מנת לפתח מדידה בקו החליבה. ידוע מהספרות כי השונות בהרכב החלב תלויה הן במאפיינים גנטים והן במצב פיזיולוגי של הפרה (Frazzi et al., 2002; Meyer et al., 2002; Ominski et al.,). בהתאם , יש קשר הדוק בין רמות והרכב רכיבי החלב העיקריים, דהיינו שומן וחלבון, לבין תנאי סביבה, כולל מזג אוויר ועונות השנה (Frazzi et al., 2002; Meyer et al., 2002; Ominski et al., 2002). כיוון ששינויים בהרכב החלבון והשומן צפויים להתבטא בספקטרום mid-IR (Stuart, 1997), נאספו דגימות מעונות שונות במטרה לבחון את ההנחה כי יש להתאים מודל חיזוי עונתי למרכיבים. מטרה נוספת הייתה להרחיב ככל הניתן את היקף המדגם כדי להימנע ממצבים של מודלים מקומיים (over fitting). לשם כך נלקחו דגימות חלב מ-72 פרות שונות.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

איור 1- תיאור סכימטי של קרינה IR המודרכת דרך גביש ATR. I - אינטרפרומטר (התקן אופטי ממנו נפלטת קרינת IR) , M – מראות, L – עדשות מרכזות, D – גלאי. החצים מתארים את כיוון התקדמות הקרינה.

 

 

3. שיטות

 

 3.1. מהלך הדגימות:

חלב גולמי נלקח במהלך חליבת פרות ברפת כפר גלים, לאורך שלוש עונות: קיץ 2005, חורף 2005-2006, וקיץ 2006. פירוט הדגימות מופיע בטבלה מס' 1. לאורך שלושת התקופות נדגמו 72 פרות, כאשר עשר מתוך 25 הפרות שנדגמו בחורף 2005-6 ותשע מתוך 26 פרות מאביב-קיץ 2006 הן פרות שלא נדגמו בקיץ 2005. פרוטוקול הדגימה האחסון והמדידה ששימש בקיץ 2005 יושם גם בניסויי חורף 2005-6 ואביב-קיץ 2006: חלב מפרות שונות נדגם לבקבוקים מעוקרים בנפח של 40ml , שלושה בקבוקים מכל פרה. בתוספת טבלית חומר משמר (MICROTAB), כשסט דגימות אחד הועבר למדידות ייחוס במעבדה המרכזית לחלב בקיסריה ושני סטים הועברו למדידות ATR/FTIR בטכניון. תוצאות מדידות הייחוס מוצגות באיור 2.

 3.2. מהלך המדידות:

כל דגימה חוממה באמבט מים ל- 0.5°C±40 , ונמדדה ע"י טבילת ה-ATR בחלב המחומם תוך כדי בחישה מגנטית. בנוסף לבקרת טמפרטורת הדגימה, הוזרם אוויר יבש ומסונן לתא ה-FTIR ולסביבת טבלן ה-ATR. טמפרטורת הדגימה והלחות בסביבת מערכת החישה האופטית נוטרו באופן רציף, והמדידות נעשו כאשר הלחות היחסית (RH) נמוכה מ-5%.

כל דגימה נמדדה ע"י טבלן ה-ATR חמש פעמים, כשכל מדידה נעשתה עפ"י המחזור הבא: ניקוי הטבלן, מדידת רקע (ספקטרום של אוויר בסביבת המערכת האופטית) , מדידת מים מזוקקים, ייבוש הטבלן, מדידת דגימת חלב, וניקוי הטבלן ע"י שטיפה במים מזוקקים מחוממים ל-40°C, שטיפה בדטרגנט פולי-אניוני, שטיפת הדטרגנט במים מזוקקים מחוממים, ושטיפה באצטון.

חלב גולמי למדידות ע"י התקן ATR בזווית משתנה ("זוויתן") חומם באמבט מים ל- 40±0.5°C , ודגימה בנפח 750µl נמזגה על פני גביש אופקי באמצעות פיפטור לפני כל מדידה. כל דוגמת חלב נמדדה בשלוש זוויות חדירה: 30°, 45°, 60°, ובכל זווית התבצעו שלוש מדידות חוזרות (סה"כ 3∗3 מדידות לכל דוגמת חלב). מחזור הניקוי זהה למחזור הניקוי במדידות הטבלן. בכל זווית התבצעה מדידת מים אחת לפני שלוש מדידות החלב.

טווח הסריקה של המערכת האופטית הותאם לקבלת אותות בספקטרום של 800-4000cm-1 , ובכל מדידה נעשו 32 סריקות כאלו על מנת לשפר את יחס האות לרעש. ומשך כל מדידה הסתכם ל-25 שניות.

 

במקביל למדידות החלב נמדדו אותות מים לטובת ייחוס, אלא שבהתאם לממצאי דו"ח הביניים, אותות אלו שימשו בעיקר לבקרה תפעולית ולבחינה ויזואלית, אך לא נעשה בהם שימוש במהלך האימון והחיזוי הכמותי.

סט נוסף (דופליקט) של 25 דגימות במהלך קיץ 2006 נמדד בהתקן זווית משתנה ("זוויתן"), בשלוש זוויות של חדירת קרינה: 30°, 45°, 60°.

סט נוסף (דופליקט) של 55 דגימות נמדד לאחר תוספת של טטראציקלין, בריכוזים של 500ppm או 1000ppm, כניסוי מקדים לזיהוי אנטיביוטיקה בחלב גולמי. סט מקביל (דופליקט) ל- 21 דגימות במהלך חורף 2005-6 נמדד בטמפרטורה של 75°C, כניסוי מקדים לאפשרות לנטר שינויי מבנה הצפויים בחלבוני מי גבינה (Ellofson et al, 1996). בשני המקרים התוצאות הראשוניות היו מאכזבות ביותר ולכן העבודה במערכי ניסוי אלו הופסקה והתוצאות לא מובאות בדו"ח הנוכחי.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
איור 2- תוצאות אנליזת חלבון שומן ולקטוז ע"י מדידות ייחוס במעבדה המרכזית לחלב. מימין: תכולת לקטוז לעומת תכולת חלבון. משמאל: תכולת שומן לעומת תכולת חלבון. ∗ - תוצאות קיץ 2005 , ° - תוצאות חורף 2005-6 , Δ- תוצאות אביב-קיץ 2006
 
 
 3.3 התקני ATR למדידות ספקטראליות של חלב גולמי בתחום ה- Mid-infrared:
כל הדגימות נמדדו ע"י טבילת אלמנט ATR מסוג ZnSe (איור 3א) המאופיין בזווית חדירה 45° של הקרינה לתוך הגביש – כך שהקרינה חודרת לשכבת עומק קבועה בחלב לכל אורך גל, ומבצעת מספר החזרות קבוע דרך הגביש. עבור זווית פגיעה של 45° בגביש ZnSe עומק החדירה נע בטווח 0.9-3.6µm עבור אורכי גל 2.5-10µm (או 4000-1000cm-1) בהתאמה. כיוון שחלב גולמי לא מהומגן מכיל גלובולות שומן באותו סדר גודל של עומק חדירת הקרינה ואף למעלה מכך (קוטר גלובולות נע בין 0.1-15µm) הבאנו בחשבון מיסוך של פאזת החלב הרזה (הפלסמה) ע"י גלובולות שומן, עם זאת צפינו שהפעלת בחישה תוך כדי מדידה תצמצם את השפעת גלובולות השומן על מדידת החלבון. בנוסף התבצעו מדידות בהתקן המאפשר שינוי בזוויות חדירת קרינה (איור 3ב). מטרת מדידות אלו הייתה לדגום שכבה עמוקה יותר על מנת לקבל אינפורמציה המייצגת טוב יותר את הדגימה, ומושפעת פחות מנוכחות גלובולות שומן. לדוגמה, עבור זווית פגיעה של 30° בגביש ZnSe עומק החדירה נע בטווח 1.65-6.6µm עבור אורכי גל 2.5-10µm (4000-1000cm-1) בהתאמה. מצד שני אלמנט ה-ATR בהתקן זה אינו טובל בדגימה, כלומר יש להעמיס עליו דגימה סטטית בנפח קטן מ-1ml ללא בקרת טמפרטורה.
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

3א - טבלן ATR דגם AXIOM 210 תוצרת AXIOM. מצויד בגביש ZnSe בקוטר 25mm, זווית חדירת קרינה: °45 מס' החזרות: 2 עומק טבילה מקסימאלי: 16.5cm . רגישות לקרינת Mid-IR בטווח 4000-650cm-1.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3ב – זויתן - התקן ATR בעל זווית חדירת קרינה משתנה. דגם ATRMAX II תוצרת PIKE Technologies . טווח זוויות חדירה של 70-20° ו-3-12 החזרות בתוך הגביש , כלומר לעומק חדירה של 0.5-10µm בהתאמה

 

איור 3- דוגמי ATR למדידות ספקטרליות של חלב גולמי

 

 

 

4. אנליזה מתמטית

תוצאות המדידות חולקו באופן אקראי לקבוצת אימון שכללה שני שליש מהמדידות לטובת כיול מודלים לחיזוי הרכב חלב (חלבון, שומן, לקטוז), ולקבוצת מבחן שכללה שליש מהמדידות. התוצאות ממדידות הטבלן התפרסו כאמור על פני שלוש עונות. על מנת לבדוק את אפקט התנודות העונתיות על יכולת החיזוי של המודלים, כל תקופת זמן נותחה בנפרד.

האנליזה התבססה על שתי גישות:

• חילוץ מרכיבי יסוד ספקטראליים ע"י (principal component analysis (PCA אשר שמשו כקלט לאימון רשתות עצביות (NN).

• ביצוע אנליזת (wavelet (WLT אשר שימש לקביעת הקלט לאימון רשתות עצביות (NN).

בנוסף, האותות הספקטראליים מקיץ 2005 נותחו לתכולת תאים סומטים.

 

בדומה לעציון (2004), כוילו מספר מודלים לא לינארים מסוג רשת עצבית (neural network - NN). כיוון שהאותות המתקבלים נותנים אפיון של הדגימה ע"י מאות בליעות בטווח רחב של תדרים, ביצענו טיפול מקדים על מנת לייצג את סט הנתונים (הבליעות) ע"י מספר מצומצם יותר של משתנים ("רכיבים יסודים" או PC). השתמשנו ב-principal component analysis (PCA המפרקת מטריצת X בגודל Nxp , שמכילה נתוני N דגימות מנורמלים עבור p משתנים נמדדים, למכפלה של שתי מטריצות קטנות יותר : מטריצת תוצאות של k רכיבים יסודיים score matrix) T) בגודל Nxk , ומטריצת מקדמים loading matrix) P) בגודל pxk.

 

 

 

 

E - מטריצת השגיאה בגודל Nxp.

העמודות של T מייצגות תוצאות לכל רכיב. כל וקטור עמודה ב- (P (loading vector מייצג טרנספורמציה בין רכיב יסודי לבין המשתנים הספקטרלים הנמדדים. מטריצות T ו-P מחושבות כך שהרכיבים היסודיים הם בלתי תלויים זה בזה. תהליך צמצום הנתונים אמור להפחית את הרעש, תוך שימוש במספר רכיבים (משתנים) מינימלי המספיק לייצוג את המידע המשמעותי בבסיס הנתונים.

משתני ה-PC שימשו גם כקלט לכיול מודלים לא לינארים של רשתות עצביות. רשת עצבית היא תהליך חישובי, המדמה את אופן פעולת המוח לצורך ביצוע משימה. הרשת העצבית בנויה מיחידות חישוב פשוטות (nodes), המקבילות לנוירונים , ומהקשרים ביניהם. חוזק הקשרים מגלם את המידע הפנימי הנדרש לביצוע המשימה, הוא מוגדר ע"י מקדמים ("משקלים סינפטים"), ונקבע בתהליך כיול המודל (המכונה גם אימון הרשת). מבנה של שכבות נוירונים וקשרים מסועפים ביניהם מאפשר לייצג ולהכליל התנהגות מורכבת, כולל התנהלות לא לינארית. מידת היכולת לייצג ולהכליל מותנה במאפייני הרשת, ביניהם מספר הנוירונים בין שכבת הקלט לשכבת הפלט (hidden nodes). כיוון שהאות ספקטרלי של חלב גולמי הוא ביטוי מורכב בחרנו ליישם את הגישה של רשתות עצביות.

עציון (2004) דיווחה כי מידע על רמת השומן או הלקטוז משפר את יכולת החיזוי של הרשתות העצביות, ולכן כוילו גם מודלים המכילים נתוני תכולת שומן ו/או תכולת לקטוז בקלט. חשוב לציין כי בדגימות שנבדקו לא קיימת קורלציה גבוהה בין ריכוז החלבון וריכוז השומן והשומן (איור 2).

 

אנליזת wavelet היא שיטה לניתוח אות לתדרים שאינם קבועים בזמן. הניתוח משתמש בפונקצית גל מוגבלת בזמן (פונקצית אם), כדי לפרק את האות לאוסף פונקציות גל המהוות הרחבה או צמצום של פונקצית האם(scaling) או היסט של פונקצית האם (shifting). השיטה מחשבת מתאם בין מקטעים של האות לאופיין של פונקצית האם, תוך שינוי רוחב הפונקציה ורזולוציה של המקטעים . כך ניתן לזהות בספקטרום בליעות אופייניות (אזורי מתאם גבוה) הניתנות לאיתור רק ברזולוצית תדרים מסוימת, שנובעות מנוכחות מרכיבים מסוימים בדוגמה. ה-wavelet לספקטרום FTIR ניתן לייצוג ע"י הפונקציה הרציפה הבאה:

 

 

 

 

כאשר (x(v הוא האות הספקטראלי כפונקציה של מספר גל v, היא פונקצית האם של ה-wavelet , ∗ מציין את הצמוד הקומפלקסי שלה, הוא פקטור ההסחה (shifting) ו-S הוא פקטור ההרחבה (S>1) או פקטור הצמצום (S<1). שיטה זו כבר שימשה למיצוי מידע מאותות FTIRלצורך כימות מרכיבים, כמו ניטרט בקרקע (Jahn et al., 2006) ותכולת מים בחיטה (Jetter et al, 2000). במחקר הנוכחי, השיטה שימשה לקביעת התדרים שישמשו כקלט לרשתות עצביות.

 

 

5. תוצאות

5.1. מדידות באמצעות טבלן ATR

טיפול מקדים בבסיס הנתונים כלל הסרת חריגים שהיוו כ-5% מכלל הדגימות וחלוקה אקראית למדגמי כיול ולמדגמי מבחן. מדגמי הלמידה והמבחן מפורטים בטבלה 2 .  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ספקטרום חלב אופייני המתקבל ממדידות טבלן מוצג באיור 4, לטווח 1100-1800cm-1 הכולל את מרבית המידע לגבי מרכיבי החלב. תנודות כיפוף במולקולות מים יוצרות בליעה חזקה סביב 1644cm-1 שחופפת לשתי בליעות הנובעות מתנודות בקשרים פפטידים של חלבוני החלב: אחת סביב 1650cm-1 המצוינת כ- Amide I ואחת סביב 1560cm-1 המצוינת כ-Amide II. בליעות נוספות החופפות לבליעת המים נמצאות סביב 1735cm-1, כתוצאה מתנודת קשר אסטרי במולקולות שומןCoates, 2000; Iñón et al, 2004)) . בתחום 1000-1300cm-1 לא ניתן להבחין בפסי בליעה ייחודיים למרכיב מסוים, אבל האזור נחשב לתחום "טביעת האצבעות" של מולקולות כמכלול בתחום זה הבליעה מורכבת מאינספור תרומות של מרכיבים בחלב, ביניהן בליעות אופייניות לפוספט אורגני בתחומים 1250-1350cm-1 ו- 990-1050cm-1 (Coates, 2000), המאפיין פוספופרוטאינים כמו חלבוני הקזאין. כפי שצוין בעבר (Etzion et al., 2004) בליעות הפוספאט הן מבדיל פוטנציאלי בין קזאין לבין חלבוני מי הגבינה. בליעות הפוספט נמצאות בחפיפה לבליעות חזקות של לקטוז בתחום 1000-1150cm-1, כתוצאה מקבוצות כוהליות בלקטוז שבחלב. בתחום 1460-1200cm-1 באות לידי ביטוי תנודות בשרשראות פחמימניות הקיימות הן במבנים חלבוניים (שיירי חומצות אמינו) והן בחומצות שומן, כמו גם תנודות של קבוצות קרבוקסיליות (Karoui et al., 2006). בנוסף לבליעות בתחום המוצג באיור 4 קיימות גם בליעות בתחום 2800-3950cm-1 . הבליעות ב-2800-3000cm-1 המאפיינות שומן בחלב, שנובעות מתנודות מתיחה של קשרי C-H בשרשראות הפחמימניות בטריגליצרידים (Dufour et al., 2000). בליעה חזקה בתחוםcm-1 3200-3600 נובעת מתנודות מתיחה במולקולות מים ומושפעת מאוד מקשרי מימן בין קבוצות פונקציונליות שונות כמו חומצות קרבוקסיליות. בליעה זו חופפת לבליעה כתוצאה מתנודות בקשר הפפטידי סביב 3400cm-1.

באיור 5 מוצגים הרכיבים הספקטרלים המתקבלים מ-PCA לספקטרה החלב גולמי שהתקבלו מהמדידות. כצפוי קשה לקשור בין הרכיבים היסודיים (PC) לבין הביטויים ספקטראליים של מרכיבי החלב השונים אליהם התייחסנו. לעומת זאת ניתוח wavelet (WLT) (איור 6) הוביל לתדרים שניתן לייחס אותם מבחינה כימית-פיסיקלית לקבוצות פונקציונאליות בחלב, הגם שהשיוך עשוי לכלול יותר ממרכיב ייחודי אחד. תחומי התדרים שנמצאו כבעלי תכולת אינפורמציה משמעותית סומנו בחצים שחורים על גבי ניתוח ה- wavelet שבאיור 6 , וסוכמו בטבלה 3, למעט wavelet סביב 2300 שנובע מ-CO2 שבאוויר. החיצים האדומים באיור 6 מסמנים wavelet שלא נמצאו בכל הרצות ה-WLT , ולכן לא נכללו בקלט לרשתות העצביות.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

איור 4- ספקטרום חלב אופייני המתקבל ממדידת טבלן ATR

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

איור 5 – שישה רכיבים ספקטראליים המתקבלים מ-PCA למטריצת אותות ATR של דגימות חלב גולמי

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

איור 6 – ניתוח wavelet לאותות חלב גולמי ממדידות טבלן ATR בתחום cm-1 800-4000

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

רכיבי ה-PC ורכיבי ה-WLT שימשו כקלט לרשתות עצביות (NN). יכולת החיזוי ע"י הרשתות השונות שאומנו נבדקה לשלושת מרכיבי החלב העיקריים: חלבון, לקטוז ושומן. כמו כן נבחנה האפשרות להשתמש במודלים של רשתות עצביות על מנת לסווג את החלב לרמת סף של תאים סומטים, ולשפר חיזוי של שלושת המרכיבים העיקריים ע"י מדידות בזוויות קרינה שונות (עמקי חדירה שונים).

 

5.1.1 חלבון:

תוצאות קביעת חלבון ע"י PCA ו-NN וע"י WLT ו-NN מסוכמות בטבלאות 4 ו-5 בהתאמה. בכל טבלה מוצגות בהבלטה התוצאות הטובות ביותר שהתקבלו לכל עונת דיגום . טיב החיזוי מיוצג ע"י שגיאת החיזוי (Error) וע"י מקדם קורלציה (R2) בין החיזוי לתוצאות מדידות הייחוס. טיב החיזוי מוצג בנפרד לקבוצת האימון (Calib.) ולקבוצת המבחן (Valid.). בטבלה 4 מוצגות תוצאות למודלים שהתבססו על PCA בתחומים הספקטראליים הבאים: 1600-1100cm-1, cm-1,1600-1400 1400-1600cm-1 + 1000-1100cm-1 (תוספת איזור ביטוי פוספוסרין), 1400-1600cm-1 + 2800-3100cm-1 (תוספת איזור ביטוי חומצות שומן , ו-קשרי מימן) 1400-1600cm-1 + 2700-2500 (תוספת איזור ביטוי של חומצות קרבוקסיליות וזרחתיות).

טיב החיזוי של רשתות עצביות המתבססות על קלט PC משתנה מאוד מעונה לעונה, כששגיאות החיזוי הנמוכות ביותר ומקדמי מתאם מאוד גבוהים מתקבלים עבור דגימות קיץ 2006. זוהי תוצאה סבירה לאור העובדה שתכולת השומן בעונה זו נעה בטווח מצומצם ובינוני-נמוך יחסית לשתי העונות האחרות (ראה איור 2), ולכן נוצר פחות "רעש" ע"י גלובולות השומן. בהתאמה לתוצאה זו נמצא כי הוספת תכולת השומן בקלט למודל משפרת את החיזוי, כפי שכבר נמצא ע"י Etzion et al (2004) עבור מודל NN לחיזוי חלבון בדגימות חלב מכוילות. באופן דומה נמצא שיעור שגיאת החיזוי לרשתות שאומנו עפ"י מדידות קיץ 2005, בהן היה טווח תכולת השומן הוא הרחב ביותר. הפעלת PCA על תחום הספקטראלי המצומצם- 1600-1400cm-1 לא השפיעה באופן משמעותי על שיעור השגיאה המינימלי בדגימות המבחן, ואף שיפרה אותו במידה מסוימת באביב-קיץ 2006. לעומתן, רשתות שאומנו לדגימות מקיץ 2005 וחורף 2005-6 הניבו קורלציות נמוכות יותר ופערי ביצוע בין מדגמי האימון ומדגמי המבחן. שימוש בתחום 1400-1600cm-1 בתוספת אזורים נוספים לא הביא לשיפור חד משמעי בכל העונות, ולא סיפק תחליף לשימוש בתכולת שומן על מנת לשפר את הדיוק. במקרים רבים נראה שתוספת האזורים הספקטראליים ל-PCA גורמת להתאמת יתר, בפוגעת ביכולת לחיזוי דגימות חדשות.

בסה"כ השגיאות המינימאליות נעות בין 0.09% ל-0.32% חלבון בעונות השונות, ומהוות 3-11% מתכולת חלבון ממוצעת בחלב.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ביצועי הרשתות בעלות קלט של מקדמי WLT מגיעות לחיזוי אופטימלי דומה, כאשר נבחרים המקדמים הקשורים לתחומים 1,4,5. חיזוי עפ"י WLTמוצלח יותר מחיזוי עפ"י PCA לגבי חורף 2005-6 אך פחות מוצלח מחיזוי עפ"י PCA לגבי קיץ 2005 וקיץ 2006. גם בסוג זה של מודל, האימון והבדיקה של דגימות מאביב-קיץ 2006 הראה שגיאות נמוכות פי שתיים לעומת שתי העונות הקודמות, ולכן נראה כי תכולת השומן משחקת תפקיד חשוב בסף הרגישות של המדידות לתכולת חלבון. בשונה מרשתות המקבלות מקדמי PC, רשתות שמקבלות מקדמי wavelet מראות פערי חיזוי ניכרים בין מדגמי האימון ומדגמי המבחן, האופייניים לבעיה של התאמת יתר. בחינת מדגמי המבחן מראה שגם רשתות אלו נותנות ביצועים טובים יותר כשהקלט כולל תכולת שומן.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

איור 7 – תוצאות חיזוי תכולת חלבון בחלב גולמי מאביב-קיץ 2006, עפ"י מודל NN המקבל 6PC בתחום 1400-1600cm-1ותכולת שומן

 

 

 5.1.2. לקטוז:

תוצאות חיזוי לקטוז ע"י PCA ו-NN וע"י WLT ו-NN מסוכמות בטבלאות 6 ו-7 בהתאמה. בכל טבלה מוצגות בהבלטה התוצאות הטובות ביותר שהתקבלו לכל עונת דיגום . טיב החיזוי מיוצג ע"י שגיאת החיזוי (Error) וע"י מקדם קורלציה (R2) בין החיזוי לתוצאות מדידות הייחוס. טיב החיזוי מוצג בנפרד לקבוצת האימון (Calib.) ולקבוצת המבחן (Valid.). בטבלה 6 מוצגות תוצאות למודלים שהתבססו על PCA בתחומים הספקטראליים הבאים: 900-1400cm-1, הוא תחום טביעת האצבעות הכללי, 1150-1450cm-1, שאמור לנטרל קצוות עם ביטוי חזק של חלבון או פוספט. כמו כן נבחנו תוספות תחומים ספקטראליים 2500-2700cm-1 או את 3100-3000cm-1 שאמורים לבטא שינויים בקשרי מימן וכן overtones של בליעות ע"י לקטוז (Iñón et al, 2004), אבל לא אמורים להיות מושפעים ספציפית מחלבון. בטבלה 7 מוצגות תוצאות של-NN עם שילובי WLT שונים:הראשון כולל מקדמים בתחום 1000-1600cm-1 (מקדמים 1-4), השני כולל את כל מקדמי ה-WLT שצוינו בטבלה 3 (1-6), והשלישי כולל מקדמים בתחום מצומצם של "טביעת האצבעות" (מקדמים 2-3).

במהלך עונות השונות הושגו תוצאות חיזוי טובות מאוד ע"י מודלים של PCA ו-NN, אבל התחום הספקטראלי האופטימאלי משתנה מעונה לעונה. מודלים לחיזוי עפ"י WLT נותנים תוצאות דומות מבחינת שגיאות אך נוטים לקורלציות יותר נמוכות, כנראה משום שביטוי הלקטוז ברכיבי WLT אינו מספיק מובהק. מולקולות הלקטוז הן קטנות (דימרים) ומומסות בפאזה המימית, ולכן לא צפוי מיסוך ע"י גלובולות שומן בשכבה החלב הנמדדת ע"י ה-ATR . בגלל ביטוי חופף של קבוצות פונקציונליות בלקטוז ובשומן בתחום 1400-1250cm-1 (Coates, 2000) בכל זאת ניסינו לשלב נתוני תכולת השומן במודל, אבל מהתוצאות ברור שקלט זה מיותר. תוצאות חיזוי לקטוז בדגימות חלב מאביב-קיץ 2006 עפ"י מודל NN & PCA לתחום 900-1400cm-1 מוצגות באיור 8.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

איור 8 - תוצאות חיזוי תכולת לקטוז לפי מודל NN&PCA לתחום 900-1600cm-1 לעונת אביב-קיץ 2006.

 

 

5.1.3. שומן:

תוצאות חיזוי שומן ע"י PCA ו-NN וע"י WLT ו-NN מסוכמות בטבלאות 8 ו-9 בהתאמה. ניתוח ה-PCA מתבסס על אזורי ביטוי של כיפוף ומתיחה בשרשראות פחמימניות, כלומר 1200-1400cm-1 ו-2800-3000cm-1, ועל ביטוי מתיחה בקשר אסטרים של חומצות שומן לגליצרול בתחום 1700-1750cm-1. ניתן לראות שקורלציות טובות מתקבלות עבור תחומים אלו בחורף 2005-6 ובאביב-קיץ 2006. השגיאות הנמוכות יחסית באביב-קיץ 2006 נובעות מטווח שומן מצומצם לערכים בינוניים. במדגם נרחב בעל שונות גבוהה וערכים קיצוניים, כמו בקיץ 2005, המודלים לא מספקים קורלציות לתכולת השומן. כנראה שהשונות הגבוהה בגודל גלובולות השומן, השונות בהרכב הכימי של השומן (הרכב חומצות שומן, אחוז טריגליצרידים) שמושפעת מאוד מתנאים סביבתיים ותנאים פיזיולוגיים של הפרה, כמו גם מתנאי האיחסון והטיפול בדגימה, מקשים על המדידה בתחום ה-mid-IR. התוצאות המתקבלות ממודלים של NN&WLT פחות טובות, כנראה משום שלא נמצאו תחומי ה-WLT מובהקים המבטאים שומן בחלב. השגיאות הגבוהות המתקבלות ממודל חיזוי שומן לדגימות אביב-קיץ 2006 עפ"י תחום 2700-3000cm-1 מוצגות באיור 9.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

איור 9 - מודל NN&PCA לחיזוי שומן בדגימות אביב-קיץ 2006 עפ"י תחום2700-3000cm-1

 

 

 

  5.1.4 רמות תאים סומטיים:

חיזוי רמות תאים סומטים על סמך ספקטרום mid-IR הוא בעייתי כיוון שלתאים עצמם אין ביטוי מובהק בספקטרום, ומשום כך מתבטא ברמות שגיאה גבוהות (לא מוצג). נעשה ניסיון לסווג חלב גולמי לרמות תאים סומטיים (SCC) כאמד עקיף למצב דלקתי בפרה. בהתבסס על השינויים המתרחשים בהרכב החלב כתוצאה ממצב דלקתי, למשל תהליכי דגרדציה של שומן וחלבון (ליפוליזה ופרוטיאוליזה) המובילים לשינויים ברמות חומצות שומן חופשיות וביחס חנקן לחלבון בחלב (Santos et al, 2003). התמקדנו בסיווג חלב מעל ומתחת לרמה של 200,000 cells/ml (200k) היות וזוהי רמת סף בעלת השלכות חשובות על איכות החלבון בחלב, ושעשויה לסייע באיתור מצב סאב-קליניים בעייתיים (Urech et al, 1999). הסיווג בוצע על סמך אותות שנמדדו בקיץ 2005 בלבד, היות שרק בתקופה זו נמצאו גם רמות חריגות של תאים, מעל 600,000 (600k) cells/ml במדידות הייחוס. הסיווג בוצע בשתי שיטות: Partial Least Squares (PLS) ו-PCA&NN. הסיווג התבסס על תחום טביעת האצבעות: 1350-900cm-1 ועל תוספת תחום 2800-3100cm-1 במטרה להכליל את אזור הביטוי של השומן ואזור ביטוי קשרי מימן של חומצות, אלא שרק שליש מהדגימות המכילות מעל 200k אכן זוהו. אותן תוצאות התקבלו לסיווג שהתבצע עפ"י תחום רציף1000-1800cm-1 הכולל את איזור "טביעת האצבעות", איזור ביטוי חלבון ואיזור ביטוי שומן. תוצאות הסיווג מוצגות בטבלה 10.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5.2 מדידות באמצעות התקן ATR זווית משתנה (זוויתן)

בעונת הדיגום האחרונה בוצעו 102 מדידות ATR ל-34 דגימות בשלוש זוויות קרינה : 30°, 45°, 60° (סה"כ נמדדו 102X3 אותות ATR). סיכום רכיבי ה-WLT של חלב גולמי ממדידות VATR מופיע בטבלה 11. הרכיבים המצוינים בהבלטה לא נמצאו ב-WLT של אותות הטבלן. מיקום רכיבים אלו מתאים מאוד לקבוצות פוספט ((1040-1080cm-1 ולשרשראות פחמימניות האופייניות לחומצות השומן (רכיבים 4, 6-9). הרכיבים מעל 3000cm-1 שנמצאו לאותות טבלן לא התקבלו ממדידות VATR. הרכיבים המשותפים לשתי צורות הדגימה מאופיינים בטווח תדרים ובטווח סקלות מעודנים יותר ע"י מדידות VATR. המדידה הסטטית ע"י ה-VATR כנראה מאפשרת עידון שהולך לאיבוד במדידת טבלן שהיא דינמית למחצה ולכן נוטה למיצוע תופעות.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5.2.1. חלבון:

תוצאות קביעת חלבון ע"י PCA ו-NN וע"י WLT ו-NN מסוכמות בטבלאות 12 ו-13 בהתאמה. מהתוצאות עולה כי אנליזת PCA מאפשרת חיזוי חלבון סביר רק עפ"י מדידות בזוויות 45° ו-60°. אנליזת WLT לעומת זאת מאפשרת חיזוי סביר גם על סמך מדידות בזווית 30°. עם זאת, כמו במדידות חלב ב-dipper, חיזוי סביר מתקבל ע"י תוספת נתון תכולת שומן או לקטוז לקלט. השגיאות ומקדמי הקורלציה המתקבלים מה-VATR גבוהים יותר לעומת תוצאות הטבלן, כנראה משום שהמדידה מתבצעת ללא חימום ובחישה, על דגימה סטטית הקטנה בשני סדרי גודל מהדגימה הנמדדת באמצעות טבלן.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5.2.2. לקטוז:

תוצאות קביעת לקטוז ע"י PCA ו-NN וע"י WLT ו-NN מסוכמות בטבלאות 14 ו-15 בהתאמה. תוצאות החיזוי עפ"י רכיבי WLT טובות יותר מאלו המתקבלות עפ"י PCA, במיוחד מבחינת קורלציה לתכולה הלקטוז האמיתית. התוצאות הטובות ביותר, בשגיאה של 0.11% לקטוז לערך, מתקבלות ע"י מדידות בזווית 45°, וקלט של כל תשעת רכיבי ה-WLT. במקרה זה התוצאות קרובות לאלו המתקבלות ממדידות טבלן לאותה עונה (ראה טבלה 7).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5.2.3. שומן:

תוצאות קביעת שומן ע"י PCA ו-NN וע"י WLT ו-NN מסוכמות בטבלאות 14 ו-15 בהתאמה. לא ניתן חיזוי השומן בדיוק סביר באף זווית קרינה, אפילו לא באמצעות רכיבי WLT הקשורים לאזורים ספקטרלים הידועים כמבטאים שומן Coates, 2000; Iñón et al, 2004) ).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

6. סיכום ומסקנות

השינויים שנמצאו בתחומים הספקטראליים הנדרשים לקביעת מרכיבי חלב בעונות דגימה שונות תומכים בצורך לכייל מודל נפרד לכל עונה. שינויים עונתיים אלו התבטאו בעיקר בחיזוי לקטוז. נמצא כי חיזוי כמות חלבון בחלב גולמי על סמך מדידות טבלן ATR מתאפשר בדיוק של כ- 0.1-0.3 % חלבון (המהווה כ- 5-15% מטווח ריכוז חלבון אופייני). תוצאות המדידות ע"י טבלן ATR מאשרות את השפעת נוכחות השומן על יכולת חיזוי תכולת חלבון, והצורך לכמת את רמת השומן על מנת לכמת את רמת החלבון בחלב גולמי לא מהומגן, בהתאמה למחקר המקדים שביצענו באמצעות דוגם ATR אופקי על דגימות חלב מכויל.

הניסיון להשתמש בביטוי הספקטראלי של השומן באותות ATR לכימות שומן לא הניב תוצאות. כפי הנראה אין קורלציה טובה בין הביטוי הספקטרלי של השומן ב-ATR , לבין כמות השומן בחלב. תוצאה זו עולה בקנה אחד עם צורך חוזר ונשנה לכלול את תכולת השומן האמיתית במודל חיזוי החלבון, אפילו במודלים שכוללים ביטויי WLT ברורים לשומן. ההשערה הינה שהקושי נובע מהשונות בגודל גלובולות השומן, ובעיקר מנוכחות מבני שומן מאותו סדר גודל של עומק חדירת הקרינה שנמדדים באופן חלקי בלבד. השיפור של חיזוי השומן בעומק חדירה גדול יותר, בזווית 30° תומך בהשערה זו, ולכן יתכן שאין מנוס מלהוסיף שלב הימגון מקדים למדידה. כימות מבני חלבון ומולקולות לקטוז משתפר דווקא בעומקי חדירה נמוכים יותר, אולי בגלל הנחתה יעילה יותר של בליעות מים, אבל המחיר הוא יחס אות לרעש נמוך יותר.

כמו כימות שומן, גם סיווג רמות תאים סומטיים עפ"י ספקטרום ATR בתחום ה-mid IR מועד מראש לקשיים, כיוון שאין קורלציה ברורה בין תאים סומטיים לבין ביטוי דלקתי בהרכב החלב. בהתאם לא נמצאה אינדיקציה ליכולת לסווג רמות תאים סומאטיים.

 

 

7. ספרות

 Coates, J. (2000). Interpration of Infrared Spectra, a Practical Approach., in Encyclopedia of Analytical Chemistry. (Ed: Meyers R.A.). John Wiley & Sons Ltd, Chichester.

 Dufour, E., G. Mazerolles, M. F. Devaux, G. Duboz, M. H. Duployer, and N. Mouhous Riou. (2000). Phase transition of triglycerides during semi-hard cheese ripening. International Dairy Journal 10:81–93.

Ellofsson, U. M., M. A. Paulsson, P. Sellers, and T. Arnebrant (1996). Adsorption during heat treatment related to the thermal unfolding/aggregation of b-Lactoglobulins A and B. Journal of Colloid and Interface Science, 183: 408–415 Emmons, D.B., C.A. Ernstrom, , C. Lacroix, and P. Verret (1990). Predictive formulas for yield of cheese from composition of milk: A review. Journal of Dairy Science, 73: 1365-1394.

Etzion Y., R. Linker, U. Kogan, and I. Shmulevich (2004). Determination of protein concentration in raw milk by mid-infrared Fourier transform infrared/attenuated total reflectance spectroscopy. Journal of Dairy Science, 87:2779-2788.

Frazzi, E., Calamari, L., Calegari, F. (2002). Productive response of dairy cows to different barn cooling systems. Transactions of the ASAE 45: 395-405. Iñón, F.A., S. Garrigues, and M. de la Guardia (2004). Nutritional parameters of commercially available milk samples by FTIR and chemometric

techniques. Analytica Chimica Acta 513: 401–412.

Jahn B. R., R. Linker, S. K. Upadhyaya, A. Shaviv, D. C. Slaughter and I. Shmulevich (2006). Mid infrared spectroscopic determination of soil nitrate content. Biosystems Engineering, 94: 505-515.

Jetter, K., U. Depczynski, K. Molt, and A. Niemöller (2000). Principles and applications of wavelet transformation to chemometrics. Analytica Chimica Acta 420: 169–180.

Karoui, R., A. M. Mouazen, E. Dufour, and R. S. J. De Baerdemaeker. 2006. A comparison and joint use of VIS-NIR and MIR spectroscopic methods for the determination of some chemical parameters in soft cheeses at external and central zones: a preliminary study. European Food Research Technology, 223: 363–371. Meyer, M. J., Smith, J. F., Harner, J. P., Shirley, J. E., Titgemeyer, E. C., Brouk, M. J. (2002). Performance of lactating dairy cattle in three

different cooling systems. Applied Engineering in Agriculture 18: 341-345.

Ominski, K. H., Kennedy, A. D., Wittenberg, K. M., Moshtaghi Nia, S. A. (2002). Physiological and production responses to feeding schedule in lactating dairy cows exposed to short-term, moderate heat stress. Journal of Dairy Science 85: 730-737.

Santos, M.V., Y. MA, and D.M. Barbano (2003). Effect of somatic cell count on proteolysis and lipolysis in pasteurized fluid milk during shelf-life storage. Journal of Dairy Science, 86: 2491-2503.

Stuart, B (1997). Biological applications of infrared spectroscopy. Wiley Publ.

Urech, E., Z. Puhan, and M. Schällibaum (1999). Changes in milk protein fraction as affected by subclinical mastitis. Journal of Dairy Science, 82: 2411.2402–

 

 

 עציון, י. (2004) אבחון מרכיבי חלבון בחלב באמצעות ספקטרוסקופיה של קרינה תחום ה-MIR. תיזה-טכניון.

לכל המבזקים....
office@milk.org.il פקס: 972-3-9564766 טל: 972-3-9564750 דרך החורש 4 , ת"ד 97, יהוד 5647003
מופעל באמצעות מעוף - מגוון אפקט