דוח סופי מס': 354-0144-06


טיפוח הפרה המתמידה


שמות החוקרים:
מרכז המחקר – נסים סילניקוב – המחלקה לבקר, המכון לבע"ח
מיכה רון – המחלקה לגנטיקה, המכון לבע"ח
יהודה וולר – המחלקה לגנטיקה, המכון לבע"ח
איל סרוסי – המחלקה לגנטיקה, המכון לבע"ח
אפרים עזרא – התאחדות מגדלי בקר

 

תקציר
החלב מכיל מערכת משוב לבקרת הפרשתו החיונית לתאום בין צורכי הוולד ליכולת הפרה לספק צרכים אלה. זוהי מערכת משוב שלילית המבוססת על הפרוטאז פלזמין שמשחרר מהסובסטרט קזאין, פוספופפטיד הגורם לירידה בייצור חלב. רוב הפלזמין נמצא במצב בלתי פעיל (פלזמינוגן). הפלזמינוגן משופעל ע"י אנזימים בשם פלזמינוגן אקטיבטור (TPA), ופעילות הפלזמינוגן אקטיבטור מדוכאת ע"י מעכבים טבעיים הקיימים בחלב. השערת העבודה המרכזית של תוכנית זו היא שתכונת ההתמדה בייצור חלב בפרות  קשורה לתת פעילות של המערכת האנזימטית שתוארה לעיל ועקב כך לריכוזים נמוכים של פוספופפטידים פעילים. התוצאות שעלו ממחקר זה  מאשרות את השערת העבודה ולכן יש עניין לזהות את המערכת הגנטית האחראית לשינויים אלה, ולבדוק האם מדובר במוטציה בגן מרכזי כגון הגן פלסמינוגן אקטיבטור האחראי לשפעול הפלזמינוגן בבלוטת החלב של פרה.
זיהוי הגורם הגנטי יאפשר פיתוח מבחן לזיהוי הפרה המתמידה.התוצאות עד לסוף מחקר זה לא זוהה גן מרכזי, אך מבחנים גנטים הראו שתכונת ההתמדה היא תורשתיתוכומוזום מספר 7 בפרה נושא סמנים הקשורים לתכונת ההתמדה. לפרות בעלות כושר התמדה יש יתרון כלכלי הנובע מהגדלה בייצור החלב, שיפור הרכבו והגברת היעילות ביצורו, ומניעת הפסדים כלכליים כתוצאה מחשיפת הפרות לסיכונים בריאותיים הנלווים להריון והמלטה.

 

מבוא ותאור הבעיה
החלב מכיל מערכת משוב לבקרת הפרשתו. מערכת זו חיונית כדי לתאם בין צורכי הוולד לצורכי הפרה. באופן כללי ככל שדרישות הוולד רבות יותר וריקון בלוטת החלב תכוף יותר, מערכת הבקרה השלילית מדוכאת ומתאפשר ייצור מרבי של חלב. חקלאי ישראל מנצלים תופעה זו מזה זמן רב ע"י חליבת הפרות שלוש פעמים ביום, ולאחרונה מתפשט ממשק חליבה של 4 פעמים ביום בתקופת הקיץ בכדי לפצות על הירידה העונתית בייצור חלב כתוצאה מעומס חום. במעבדה לפיזיולוגיה של ייצור החלב במכון וולקני "פיצחנו" לראשונה את מנגנון מערכת הבקרה של הפרשת החלב , כפי שמתואר להלן ומסוכם באיור מס' 1. החלב מכיל מערכת אנזימטית  (פלזמין) לפרוק קזאין. רוב הפלזמין נמצא במצב בלתי פעיל (פלזמינוגן). הפלזמינוגן משופעל ע"י אנזים בשם פלזמין אקטיבטור, ופעילות הפלזמין אקטיבטור מדוכאת ע"י מעכבים טבעיים הקיימים בחלב. כשליש מהחלבונים במקטע מי הגבינה מורכבים מתוצרי פרוק של קזאין. פלזמין הנו האנזים העיקרי המצוי בחלב פרות ויונקים אחרים. לפלזמין זיקה למולקולת הקזאין והוא חותך את הקזאינים סמוך למולקולות סרין, תוך שחרור מקטעים חלבוניים קצרים, שחלקם עתיר בזרחן (פוספופפטידים). במחקרים שנעשו במעבדתנו ב- 5 השנים האחרונות [1-5] נמצא שלפוספופפטידים אלה תפקיד מרכזי בעיצוב עקומת התחלובה ובמעבר משלב תחלובה לשלב היובש.
אחד מהשערות העבודה המרכזיות של תוכנית זו היא שתכונת ההתמדה בייצור חלב בפרות  קשורה לתת פעילות של המערכת האנזימטית שתוארה לעיל ועקב כך לריכוזים נמוכים של פוספופפטידים פעילים, שהם הגורם לירידה בייצור חלב. במידה שנאשר את השערת העבודה, יהיה עניין לזהות את המערכת הגנטית האחראית לשינוים אלה, ולבדוק האם מדובר במוטציה בגן מרכזי כגון ה-TPA, שהוא הגן האחראי לביטוי הפלזמין אקטיבטור. העיקרי בבלוטת החלב של פרה מהרקמה המפרישה.
זיהוי הגורם הגנטי יאפשר פיתוח מבחן לזיהוי הפרה המתמידה. ניתן יהיה להגן על מבחן זה בפטנט, שיאפשר מימוש עסקי של המידע הגנטי החשוב למשק החלב. לפרות בעלות כושר התמדה יש יתרון כלכלי הנובע מהגדלה בייצור החלב, שיפור הרכבו והגברת היעילות ביצורו, ומניעת הפסדים כלכליים כתוצאה מחשיפת הפרות לסיכונים בריאותיים הנלווים להריון והמלטה.

 

איור 1: סכמה המתארת את מנגנון המשוב השלילי לבקרת הפרשת חלב מבלוטת החלב

 

 

מטרת המחקר
לגבש טכניקה לזיהוי הפרה המתמידה על ידי שילוב הגישה הביוכימית (אפיון מערכת הפלזמין- CPP) הביואינפורמטיבית (זהוי מאפיינים ביואינפורמטיבים)- סטטיסטית  והגנטית(זהוי שונות גנטית).


תוכנית המחקר
1. הגישה הביוכימית

הושוותה פעילות מערכת הפלזמין בפרות שעקומת התחלובה שלהם "נורמלית" (דהיינו, הפרות מיובשות ב300 יום בתחלובה, או כ-60 יום לפני ההמלטה הצפויה, תוך ירידה משמעותית בייצור החלב בהשוואה לייצורו בשיא התחלובה) בהשוואה לפרות "סופר-מתמידות" ( פרות שלא יובשו והיו בתחלובה בממוצע כ-700 יום ). נסיון לפתח שיטה אימיונית (פיתוח נוגן חד-שבטי) לבדיקת ריכוז  CPP , הבשיל רק לאחר סיום התוכניתת והתוצאות שלו עדין נבחנות.

 

2. הגישה הביואינפורמטיבית סטטיסטית
נסקרו נתוני ההתמדה בבקר לחלב בישראל ופורסם מאמר מדעי המתאר את אופן הדיגום וניתוח הצוצאות (6). בקצרה, נבדקו מעל ל-18 מיליון רשומות ספר העדר של למעלה לחצי מיליון פרות . הושוו התחלובות (ראשונה עד חמישית, איור 2) לשונות ולמתאם ביניהםץ חושבו מתאמים בין התמדה לתכונות יצור, פוריות ואורך חיים בעדר.

 

3. הגישה הגנטית
בסריקת גנום הבקר לחלב בישרא לגנים כמותיים  הנעשית במחלקה לגנטיקה במינהל המחקר החקלאי נקבעו בעבר גנוטיפים ל-90 סמנים מיקרוסטליטים הפזורים בכל האוטוזומים במשפחות המובילות (7). במהלך 7 השנים האחרונות, הורחב הפרויקט, ונקבעו גנוטיפים ל-5949 פרות, בנות 11 פרים, עבור 120 סמנים גנטים מיקרוסטליטים. במסגרת עבודת דוקטורט של מ. גוליק (בהנחיית: וולר, סילניקוב וסרוסי) השתמשנו בנתונים שנצברו כדי לסרוק את הגנום להתמדה בהתאם למדדים שהוגדרו בגישה הקודמת. הסריקה  נעשתה במבני בתי אב בהם מחולקות בנות הפר עבור כל סמן גנטי, לשתי קבוצות על פי האלל האבאי שהורש להן (איור 3).


שיטות
השיטות לאיפיון מערכת הפלזמין פורטו בפרסומים קודמים (1-5). בקיצר, המערכת מורכבת מפלזמינוגן (פלזמין בצורתו הזימוגנית הבלתי פעילה), מפלזמינוגן אקיבטור (האנזים המשפעל את הפלזמין לצורתו הפעילה), ופלזמין (הצורה הפעילה של האנזים).פעילות פלזמין נקבעת בצורה קולורימטרית ע"י שימוש בסובסטרט ספציפי לפלזמין היוצר צבע עם פרוקו באופן לינארי לכמות הסובסטרט המפורקת. כמות הפלזמינוגן (ביחידות פעילות של פלזמין) נקבעת ע"י הוספת עודף של פלזמינוגן אקטיבטור, המפרק את כל הפלזמינוגן לפלזמין. כמות הפלזמינוגן אקטיבטור נקבעת ע"י הוספת פךזמינוגן ומדידת כמות הפלזמין הנוצרת.
השיטה הביואינפורמטיבית והשיטה הגנטית תוארו הפרוטרוט במאמר 6.

 

 איור 2: מבנה בתי אב

 

 


תוצאות
הגישה הביוכימית
בתחילת העבודה הוגדרה הפרה המתמידה לפי פנוטיפ מסוים הנובע באופן שרירותי מהחלטת הרפתן ברפת מסוימת. דהיינו, הפרות המתמידות הוגדרו ככאלו שהיו בלקטציה לפחות 600 יום וייצרו כמות חלב שהצדיקה את החזקתם ברפת ( 30 ליטר ליום ויותר).

מטבלה 1 ומאיור מספר 1 נראה שההתמדה לכשעצמה, לא היתה מלווה בירידה משמעותית בייצור חלב וייצור החלב, ייצור חלבון ושומן  בקבוצת ההקש וקבוצת הביקורת היו דומים גם ברמה של המידגם וגם ברמה הארצית.
בטבלה מס. 1 אנו מציגים תוצאות המאשרות את הנחת העבודה עליה מתבססת הגישה הביוכימית; דהיינו, שתכונת ההתמדה בייצור חלב בפרות  קשורה לתת פעילות של המערכת האנזימטית שתוארה לעיל וקרוב לוודאי שהפעילות הנמוכה של פלזמין מלווה גם בריכוזים נמוכים של CPP בחלב.ריכוזים נמוכים של פוספופפטידים פעילים.


טבלה 1. השוואה בין תכונות פרה רגילה ופרה מתמידה

 

 

איור מספר 1: שינויים בייצור חלב (MY), חלב מושווה מוצקים (CMY), % חלבון (PROTEIN), ו-% שומן ׁ(FAT) כוונקציה של ימים נתחלובה על בסיס ניתוח נתונים מספר העדר (כ- אלף פרות בכל קבוצה)

 
הגישה הביואינפומטיבית-סטטיסטית
מאיור 2 נראה באופן ברור שישנה שונות באופי עקומת  התחלובה של פרות מבכירות בהשוואה לעקומת התחלובה בפרות  בתחלובות העוקבות. כדי לפתור בעייה זאת הוגדרה ההתמדה כמשתנה רציף: היחס בין תפוקת השיא של החלב לתפוקה שהתקבלה שישה חודשים אחריו.


איור מס 2    עקומות תחלובה של פרות בישראל כפונקציה של מספר התחלובה

 

 

נתוני ספר העדר על תורשתיות של תכונת ההתמדה ועל שיפור בתכונת ההתמדה, הנובע כניאה מטיפוח בלתי ישיר לתכונה (איור 3). העליה בהתמדה מעידה שקיימת שונות גנטית בעדר כלפי התכונה ושניתן לנצל תכונה זאת לטיפוח מואץ כלפי התכונה. התורשתיות הגבוהה ביותר נמדדה בתחלובה השלישית והגיעה לכלל של 27%; ערך זה נחשב למקדם תורשתיות גבוה . התורשתיות הנמוכה ביותר שגם היא אינה זניחה  נמדדה בתחלובה הראשונה (17.3%). יחד עם זאת קיים מתאם גנטי גבוה בין התחלובות (0.9 בין תחלובה ראשונה לשנייה) ולכן במידה ורפתן יהיה מעוניין לנצל את פוטנציאל התחלובה בעדר שלו, הוא יוכל להתבסס על נתוני ההתמדה בתחלובה הקודמת.

 

איור 3. שינויי ם במקדמי ההורשה  של כלל הפרות שנבחנו להתמדה כפונקציה של זמן (הסבר מפורט להגדרות המקצועיות ואופן הגדרתם מופיע ברפרנס 6)

 


 

הגישה הגנטית

התוצאות של סריקת הגנום כפי שהוסבר בחומרים ושיטות מובאות בטבלה 2. ערך ה-F המובהק ביותר נמצא עבור הסמן הגנטי DIK2211 בכרומוזום מספר   7(מוקף במסגרת בטבלה 2), באזור המזוהה עם גן כמותי לפוריות. קיים גם מתאם גבוה בין הפרים שהתפצלו לפוריות ובין אלו שהתפצלו להתמדה. יתכן לכן שמדובר בגן זהה אן בתאחיזה הדוקה הנובעת מהקירבה הפיזית בין 2 הגנים. רק בדיקות נוספות שימפו את הכרומוזום במרווחים צפופים יותר יאפשרו להפריד בין 2 האפשרויות.


טבלה 2: סריקת כרומוזום מספר 7 להתמדה ותכונות ייצור נוספות

 


 

דיון
בעבודה זו הנחנו שלמערכת הפלזמין בחלב תפקיד מרכזי בעיצוב עקומת התחלובה ובמעבר משלב תחלובה לשלב היובש (ראה איור 1).
אחד מהשערות העבודה המרכזיות של תוכנית זו היא שתכונת ההתמדה בייצור חלב בפרות  קשורה לתת פעילות של המערכת האנזימטית שתוארה לעיל ועקב כך לריכוזים נמוכים של פוספופפטידים פעילים, שהם הגורם לירידה בייצור חלב.
תוצאות העבודה כפי שסוכמו בטבלה 1 אומנם אשרו הנחה זו. פעילות נמוכה של פלזמין ותוצרי הפרוק של פלזמין לכן יכולים לשמש ככלי בידי החקלאי להעריך האם פרה מסוימת בתחלובה היא בעלת פוטנציאל התמדה במידה ויוחלט לא ליבש אותה.
שאלה נוספת ששאלנו: האם יש קשר בין הפעילות הפנוטיפית לבסיס הגנטי, דהיינו האם ישנם ממצאים גנטיים היכולים לאשש את ההיפותזה הפיזולוגית שתוארה לעיל? לצערנו, לא מצאנו במחקר זה קשר בין התופעה הפנוטיפית של פעילות פלזמין לממצאים גנטיים היכולים להסביר אותה. ניתן להסביר זאת במספר האפשורויות העצום (נחקרו רק גן אחד מכל הגנים של הפרה) ובמורכבות המערכת ובמספר הרב של הגנים העשויים להיות מעורבים.
יחד עם זאת, הגישה הגנטית הניבה פרות והראתה בברור  שיש בסיס גנטי לתכונת ההתמדה. גם עם האמביציה לזהות גן ספציפי לא התממשה, תוצאות המחקר עשויות לתרום לשיפר יכולת ההתמדה של הפרה הישראלית ע"י שלוב של שיטות טיפוח קלסיות תוך שילוב גישות מודרניות יותר של שימוש בסמנים גנטים, QTL.

 

סיכום הממצאים העיקריים
הוכח כי קיימת תורשתיות של התמדה בעדר הישראלי. במידה ורפתן יהיה מעוניין לנצל את פוטנציאל התחלובה בעדר שלו, הוא יוכל להתבסס על נתוני ההתמדה בתחלובה הקודמת.ניתן להגביר את שכיחות ההתמדה ע"י בחירה של פרים המצטיינים בתכונה זאת. נמצא סמן מבטיח הנמצא בתאחיזה הדוקה לתכונה בכרומוזום מספר 7, ולכן זהוי הגן עשוי לשפר את הטיפוח לתכונה. התוצאות גם תאמו את ההשערה שהועלתה בגישה הביוכימית, ולכן זהוי פרות עם פעילות נמוכה של מערכת הפלזמין- CPP בחלב עשוי לסיע בזהוי פנולוגי של תכונת ההתמדה.

 
הערכת הפוטנציאל הכלכלי
בסוס הרפת החלב בארץ על פרות המתמידות בתחלובה למשך 4 עד 6 שנים רצופות יעלה את הייצור של הענף ב שישית יחסית למצב הקיים, כיוון שהפרות יניבו 12 חודשים בהשוואה ל-10 חודשים. תוספת הייצור מסעיף זה בלבד שווה כ-350 מיליון ₪ לשנה. ההתייעלות כתוצאה מהקטנת התחלופה והגדלת יעילות ניצולת המזון גם היא נכבדה ביותר ותעלה באופן ניכר את הרווחיות לחקלאי ותקטין את העומס האקולוגי בקנה מידה ארצי.

 

רשימת ספרות

 

1. Shamay, A., S. J. Mabjeesh, and N. Silanikove. 2002. Casein-derived phosphopeptides disrupt tight junction integrity, and precipitously dry up milk secretion in goats. Life Sci. 70:2707-2719.
2. Shamay, A., F. Shapiro, G. Leitner, and N. Silanikove. 2003. Infusion of casein hydrolyzates into the mammary gland disrupt tight junction integrity and induce involution in cows. J. Dairy Sci. 86:1250-1258.
3. Silanikove, N., F. Shapiro, A. Shamay, and G. Leitner. 2005a. Role of xanthine oxidase, lactoperoxidase, and NO in the innate immune system of mammary secretion during active involution in dairy cows: manipulation with casein hydrolyzates. Free Radic. Biol. Med. 38:1139-1151.
4 Silanikove, N., J. Iscovich, and G. Leitner. 2005b. Therapeutic treatment with casein hydrolyzate eradicate effectively bacterial infection in treated mammary quarters in cows. Pages 327–332 in Mastitis in Dairy Production: Current Knowledge and Future Solutions, H. Hogeveen, ed. Wageningen Academic Publishers, Wageningen, the Netherlands.
5. Silanikove, N., U. Merine, and G. Leitner. 2006. Physiological role of indigenous milk enzymes: An overview of an evolving picture. Int. Dairy J. 16: 533-545
6 Weller, J. I., G. Leitner and E. Ezra. 2006.  Genetic analysis of persistency in the Israeli Holstein popoulation by the multitrait animal model. J. Dairy Sci. 89: 2738-2746.

לכל המבזקים....
office@milk.org.il פקס: 972-3-9564766 טל: 972-3-9564750 דרך החורש 4 , ת"ד 97, יהוד 5647003
מופעל באמצעות מעוף - מגוון אפקט