דוח סופי לתכנית מחקר מס' 261-0480-08


הגברת עמידות ליובש בצמחי קיטניות באמצעות שינוי הרכב חומצות השומן בממבראנה


ע"י:
רבקה ברג - המכון למדעי הצמח, מינהל המחקר החקלאי, מרכז וולקני בית דגן
יחיעם זלץ - המכון למדעי הצמח, מינהל המחקר החקלאי, מרכז וולקני בית דגן
גוזל בן-חיים – המכון למדעי הצמח, מינהל המחקר החקלאי, מרכז וולקני בית דגן
שרה שבתאי - המכון למדעי הצמח, מינהל המחקר החקלאי, מרכז וולקני בית דגן


הממצאים בדו"ח זה הינם תוצאות ניסויים.
הניסויים אינם מהווים המלצות לחקלאים

 


תקציר
שיפור העמידות ליובש בקיטניות עתירות יבול, דוגמאת תלתן, הכרחית לשם שילובם במחזור הגידולים באזורים שמדרום לקו הבצורת. מטרה המחקר לבחון את האפשרות לשפר את הסבילות לעקת מים בזן התלתן "תבור" באמצעות גישה ביוטכנולוגית המבוססת על התמרת הטרנסגן 35S::FAD3 . שנת המחקר השניה הוקדשה להמשך פיתוח פרוטוקול יעיל לרגנרציה לאחר טרנספורמציה בזן "תבור" . לשם כך נבחנו ושונו פרוטוקולים שפורסמו בספרות לגבי מיני קיטניות שונים. על סמך ממצאי הניסויים בשנה הראשונה, בשנה השניה ערכנו סדרת ניסויי טרנספורמציה בהם האקספלנט היה פסיגים נושאי פטוטרות שמקורם מזרעים מותפחים בקור למשך 24 שע' ואשר נמצאו כמקור מוצלח יותר לרגנרציה, וכן בחנו השפעת צרופי הורמונים שונים נוספים. למרות שבססנו פרוטוקול יעיל לקבלת ניצרונים לאחר התמרה בחיידקי אגרובקטריום לא הצלחנו לקבל צמחים טרנסגנים. אנליזה של צביעת GUS שנערכה בפרקי זמן שונים לאחר הטרנספורמציה, מצביעה על כך שהתרחשה טרנספורמציה יציבה, אולם הרגנרציה התרחשה מתאים שבקרבת הרמה המותמרת ולא מהתאים המותמרים עצמם. ההבדל בין תאים בכושרם לעבור טרנספורמציה ורגנרציה הוא שורש הבעיה. אנו מציעים בעתיד לבחון פרוטוקולים אחרים שאולי יגבירו שיעור טרנספורמציה בתאים ששמרו על יכולת רגנרציה


מבוא, רקע מדעי קצר ומטרות המחקר.
גידול קטניות למספוא בישראל נעשה מתוך הכרח לקיים מחזור גידולים בשטחי הבעל. בדרום הארץ, הכולל את חבל לכיש, הנגב הצפוני והנגב המערבי, נהוג לשבץ קטניות למספוא במחזור הגידולים רק אחת ל-3 עד 5 שנים. הסיבה העיקרית לכך נובעת מרווחיות נמוכה של הקטניות למספוא. באזורים הדרומיים לקו הבצורת, עקב החשש מרמת משקעים נמוכה מ-300 מ"מ גשם בשנה ועקב עונת גשמים קצרה, מגדלים בעיקר אפונת שדה שמשך גידולה קצר משל הבקיות והתלתן. אולם כאמור עקב חוסר הרווחיות בגידול אפונת שדה למספוא, נהוג באזורים אלה לשבץ את גידול האפונה רק אחת לחמש שנים.
הקניית סבילות ליובש לבקיות ותלתן עשויות לגרום לכניסת גידולים אלה לאזורי הבצורת ולדחוק את גידול האפונה שאינו רווחי. עם התרחבות הידע אודות המנגנונים הביולוגיים המעורבים בתגובה ליובש, דווחו לאחרונה מניפולציות טרנסגניות בגנים-מועמדים שונים שנעשו במטרה לשפר עמידות לעקת יובש, בעיקר, בצמחי מודל (לדוגמא, סקירות: (Bhatnagar-Mathur et al 2008, Umezawa et al 2006, ( Shao et al 2009 ; . במסגרת תוכנית מחקר קודמת הראנו שניתן להגביר עמידות ליובש הן בצמחי טבק והן בעגבניה על-ידי הגברה מכוונת ברמת אי-הרויה של חומצות השומן בממבראנות התאים. הדבר נעשה באמצעות מניפולציה ביו-טכנולוגית שהתבססה על ביטוי ביתר של שני טרנסגנים: 35S::Fad3 ו – 35S::FAD8 המבקרים שניהם ביטוי אנזימים מסוג דה-סטוראזות המגבירים את רמת אי-הרוויה (דה-סאטורציה) של חומצות השומן הממבראנליות: כאשר האנזים FAD3 פועל בממבראנות המיקרוסומאליות (ER+PM) והאנזיםFAD8 פועל בממבראנות הפלסטידיאליות . (Zhang 2005)
ישום ממצאי המחקרים הקודמים שלנו לגידולי קיטניות למספוא מותנה כמובן בקיום פרוטוקולים לטרנספורמציה ולאחריה רגנרציה של צמחים מהתאים המותמרים. מסקירת הספרות, לא מצאנו אף דיווח על בקיה ארגמנית טרנסגנית. המינים הקרובים ביותר לגביהם נראה שקיימים פרוטוקולים סבירים הם: בקיה צרפתית (Pickard et al 1991) ( (Vicia narbonensis) ובקית הגינה (פול, (V. faba (Bottinger et al 2001) כמו כן פורסמו פרוטוקולים לטרנספורמציה בתלתן אדום ובאספסת. Sullivan &, Quesenberry 2006)), הרבה מהפרוטוקולים התבססו על יצירת תרחיף תאים אמבריוגני ששימש כאקספלנט עליו נעשו טיפולי הטרנספורמציה והרגנרציה. הבעיה העיקרית של פרוטוקולים אלו הם משך הזמן הממושך, הסכנה של צבירת מוטציות תוך כדי הריבוי הממושך של התאים בתרבית והיעילות הנמוכה של רגנרציה של צמחים טרנסגניים (ראה סקירה של Somer et l)


מטרת המחקר היתה לבחון האם שינוי ברמת הדה-סטורציה של החומצות השומניות על ידי ביטוי ביתר של הגן fad3 (35S::FAD3) עשוי להגביר באופן משמעותי את הסבילות לעקת יובש במיני קיטניות. למרות שבתוכנית המוגשת חשבנו להתחיל בניסויי התמרה לבקיה או לפול, הרי שבעקבות התיעצות עם הגורמים המקצועיים הועלתה החשיבות של הקניית עמידות ליובש דוקא לתלתן אלסנדרוני מזן "תבור" שהוא הזן המוביל בארץ להאבסת בע"ח. ועל-כן הוחלט לרכז מאמץ בפיתוח פרוטוקול טרנספורמציה לזן זה של תלתן


פירוט עיקרי הניסויים שבוצעו וכלל התוצאות שהתקבלו לתקופת הדוח, דיון ומסקנות
שנה א'
א. בחינת שימוש בפטוטרות ובעלים כאקספלנטים לרגנרציה: בעקבות הפרוטוקול שפורסם בספרות ) Sullivan & Quesenberry 2006) הממליץ על שימוש בפטוטרות עלים כאקספלנטים לרגנרציה וטרנספורמציה בקיטניות בחנו בסדרת ניסויים גדולה את יכולת הרגנרציה של צמחונים מפטוטרות, ומעלים של תלתן אלכסנדרוני מזן "תבור" וזאת במספר צרופי הורמונים צמחיים שונים ובשני סוגי אגר להקשיית מצע הגידול. נמצא ששני מקורות האגר לא נבדלו בהשפעתם על התפתחות קאלוס. טבלה 1 מסכמת חלק מהניסויים השונים של גידול האקספלנטים במצעים עם הרכבי ההורמונים השונים, ומתוכה עולה שלא התקבלה רגנרציה של ניצרונים נורמאלים באף אחד מהטיפולים.
ב. בחינת שימוש בתת פסיגים כאקספלנטים לרגנרציה: מכיון שבהרבה גידולים דווקא תת הפסיג הוא האקספלנט המועדף, בחנו בסדרת ניסויים נוספת את כושר הרגנרציה מרקמה זאת. נבחנו צרופים שונים של אוקסינים שונים טבעיים וסינטטים (IAA, NAA, 2,4-D) ושל ציטוקינינים שונים טבעיים וסינטטים ומעכב חימצון של ציטוקינין (Zeatin, Kinetin, BAP, TDZ). למרות שהתקבל הרבה מאד קאלוס בחלק מהצרופים ולעיתים גם ניצרונים התפתחו , יעילות הרגנרציה היתה עדין מאד נמוכה ורובה לכיוון שורשים.( לדוגמא תמונה 1)
ג. בחינת שימוש בפסיגים מזרעים מותפחים כאקספלנטים לרגנרציה
בהמשך בעקבות הפרוטוקול של Ding et al 2003 הוחלט להחליף את הרקמה שמשמשת כמקור לאקספלנטים לרגנרציה. במערכת זו השתמשנו בפסיגים שנחתכו מתוך זרעים סטריליים שהותפחו במקרר במשך כ-24 שעות. גם כאן נבחנו מספר צירופים הורמונאליים וכן נבחנה האפשרות לשנות את מקור הפחמן מסוכרוז לגלוקוז. פה התוצאות הראשוניות היו הרבה יותר מעודדת ובסדרת ניסויים ארוכה ומפורטת נראה שלפחות שני פרוטוקולים מובילים לרגנרציה של צמחונים בשכיחות גבוהה למדי. (שניים מהניסויים מסוכמים בטבלה 2, ראה תמונה 2).


טבלה 1: סיכום סדרת ניסויים לבחינת השפעת ההרכב ההורמונאלי של מצע בגידול על רגנרציה מפטוטרות ומעלים.


תמונה 1: שימוש בתת פסיגים כאקספלנט. חלה התמינות מעטה בעיקר לשורשים במצעים עם הרכבים הורמונאליים שונים.


טבלה 2. סיכום חלקי של סדרת ניסויים לבחינת השפעת ההרכב ההורמונאלי של מצע בגידול על רגנרציה מפסיגים של זרעים מותפחים.


תמונה 2: התמינות יעילה של ניצרונים מפסיגים שנותקו מזרעים שהותפחו בקור במשך 24 שע'.מוצגים ניצרונים שהתמיינו במצע מזון CIM עם הרכבים הורמונאליים שונים .המספרים מציינים ריכוז ההורמונים (מ”ג/ליטר) ומצוינים מספר הימים של גידול במצע. Z=zeatin, K=Kinetin TDZ=Tidiazuron ,NAA=naphtylacetic acid IAA=indoleacetic acid,

 


דיון, מסקנות והשלכותיהן על המשך ביצוע המחקר:
מאחר והפרוטוקולים שפורסמו בספרות נמצאו בלתי יעילים להשראת רגנרציה בזן התלתן תבור, שנת המחקר הראשונה, הוקדשה להקמת מערכת רגנרציה יעילה בתלתן אלכסנדרוני מזן "תבור" .הממצא החשוב ביותר הוא שפסיגים שמקורם מזרעים מותפחים הם האקספלנט המתאים ביותר לרגנרציה יעילה. כמו-כן נמצא שרגנרציה של צמחונים נורמאליים מתרחשת בנוכחות ריכוזי אוקסין נמוכים, עם העדפה להורמון הטבעי IAA. גם הציטוקינין הטבעי Zeatin וכן TDZשמעכב פעילות של האנזים המחמצן ציטוקינינים עדיפים על ציטוקינים סינטטים.


שנה ב'
כיול טיפולי ההדבקה באגרובקטריום:
בניסויי ההתמרה הראשונים פרוטוקול ההדבקה בחיידקים היה דומה לזה שמקובל להתמרת עגבניה וטבק. אולם ראינו שהפסיגים סובלים מאד (משחירים) מעצם ההדבקה בחיידק. במהלך מספר ניסויים שונו תנאי ההדבקה ונקבע לבסוף שריכוז החיידקים במדבק יופחת מאד (O.D 0.3-0.4) , קוצר משך זמן האינקובציה עם תרחיף החיידקים ל-30 דקות בלבד, ובשונה מהפרוטוקולים המקובלים, האקספלנטים הועברו למצע חדש עוד באותו יום (כ- 5 שעות לאחר ההדבקה). כל השינויים הללו במשטר ההדבקה הפחיתו במידה נכרת את ההשחמה של האקספלנטים. (תמונה 3, לוח ימיני בהשוואה לשמאלי). בהמשך המחקר העלנו את ריכוז החידקים ל- 0.4-0.5 OD, והעברה למצע עם גורם הסלקציה קנמיצין נעשתה רק יומיים לאחר ההדבקה בחידקים.


תמונה 3: השפעת משטר ההדבקה באגרובקטריום על השחמת מהפסיגים. לוח ימין- הדגרה 60 דקות,, חידקים בריכוז O.D 0.7, משמאל הדגרה 30 דקות , חידקים בריכוז O.D .0.35

 


המשך בחינת מצעי גידול שונים לשיפור הרגנרציה
כשחזרנו על חלק ממשטרי הרגנרציה שנבחנו בשנה הראשונה ונראה היה שהובילו לניצרונים שהשתרשו (תמונה 2) לא הצלחנו לחזור למצב שבו ניצרונים משתרשים. אנו משערים שהממצאים הראשוניים של הצלחה לכאורה בקבלת השתרשות נבעה מכך שבזמן הפרדת הפסיגים, לא תמיד היתה הפרדה מלאה של הפסיג והפטוטרת מהניצן החייקי של הפסיגים, כך שיתכן מאד שמה שנראה כהתחלה של רגנרציה מרקמה וגטטיבת היה בחלק מהמקרים פריצה של מריסטמה חייקית או קוקודית שלא הורחקה. על כן בהמשך הניסויים היתה הקפדה על שימוש כאקספלנט בפסיג בתוספת זעירה של הפטוטרת שלו. במקרים שהיה חשד שהניצרון התפתח מניצן חיקי או קודקודי (בד"כ הופיע כהתמיינות מאד מהירה תוך ימים ספורים) הוא הורחק ולא נכלל בהמשך הניסוי. רשימה של עיקר הרכבי המצע שנבחנו בשנה השניה מוצג בטבלה 3. נושא נוסף שנבדק שנית היה הרכב הסוכרים: מהשוואה של התמיינות במצע המכיל סוכרוז לעומת מצע המכיל גלוקוז, נמצא ששיעור הרגנרציה גבוה יותר והניצרונים בעלי מופע יותר נורמאלי במצע המכיל בסוכרוז כמקור הפחמן.
נערכו 9 ניסויי טרנספורמציה, שיעורי ההעברה של אקספלנטים למצעים השונים בשישה מהניסויים מובאים בטבלה 4. המסקנה המבוססת ביותר היתה שהעברה של פרימורדיות שהתמיינו בנוכחות ריכוז גבוה יחסית של ציטוקנינים ( TDZ או Zeatin ) למצעים שבהם הופחת הריכוז שלהם פי עשר שיפר מאד את התמיינות הניצרונים. (תמונה 4).


טבלה 3: הרכב מצעי המזון (כמויות לליטר מצע) העיקריים ששימשו בניסויים השונים לרגנרציה לאחר טרנספורמציה.( בעקבות Sullivan & Quesenberry 2006 , עם שינויים)


תמונה 4: התמיינות ניצרונים בבמצע CIM2-TDZ ובנוכחות קנמיצין


טבלה 4: סיכום מספר האקספלנטים שהועברו לכל שלב של רגנרציה לאחר התמרה באגרובקטריום נושא הפלסמיד לביטוי 35S::FAD3 בניסויי הטרנספורמציה השונים. הועברו רק האקספלנטים שנראה היה שהתחילו או המשיכו להתמיין.


דיון, מסקנות והשלכותיהן על המשך ביצוע המחקר:
מאחר והפרוטוקולים שפורסמו בספרות נמצאו בלתי יעילים להשראת רגנרציה וטרנספורמציה בזן התלתן תבור, שנת המחקר השניה הוקדשה לבחינת פרוטוקולים שונים לטרנספורמציה. מערכת רגנרציה יעילה בתלתן אלכסנדרוני מזן "תבור" .הממצא החשוב ביותר הוא שפסיגים שמקורם מזרעים מותפחים הם האקספלנט המתאים ביותר. וכן שופר פרוטוקול ההדבקה בחיידק. מכיון ששיעור הרגנרציה לאחר טרנספורמציה היה נמוך בשנת המחקר השלישית נערכו ניסויים עם גן מדווח 35S::GUS-int שקל לבחון את ביטויו היציב כבר בשלב מוקדם של בהתמיינות ניצרונים. כמו-כן לאור קשיי ההשתרשות של הניצרונים ניבחנו טיפולים הורמונאליים נוספים להשרשה.
שנה ג'
מודיפיקציה של משטר הכנת הפסיגים להתמרה: במהלך כל הניסויי הרגנרציה והטרנספורמציה נתקלנו בבעיה חוזרת של זיהום חיידקי קשה שהופיע כשבועיים עד שלושה שבועות לאחר התחלת הניסויים. הזיהום הופיע באופן ברור מתוך הרקמה הצמחית, והיה עמיד הן לאנטיביוטיקה כלאפורם המשמשת לדיכוי גדילת חיידקי אגרובקטריום והן לקנמיצין המוסף כגורם הסלקציה, ומעכב חידקים גראם-שליליים. הבעיה הופיעה כשהשתמשנו בזרעי תלתן שמקורם מאיסופים שונים של זרעים. העובדה שהזיהום הופיע ברקמה שמוצאה מזרעים שעברו סטריליזציה, הצביעה על האפשרות שמדובר בחיידק אנדופיטי "רדום" שנמצא בתוך רקמת הזרע/ העובר. כדי לנסות להתגבר על בעיה זו , שהובילה לאובדן רוב האקספלנטים בניסויים רבים, שונה משטר ההכנה של הזרעים: כדי לעודד התעוררות וגדילה של החידקים האנדופיטיים לפני החשיפה לטיפול הסטריליזציה, הזרעים הותפחו במים בטמפרטורת החדר למשך כ-18-24 שעות, ורק אז נעשה טיפול הסטריליזציה, שלאחריו נעשה תהליך שיחרור שני הפסיגים כל אחד עם הפטוטרת שלו מתוך העובר המותפח, הפסיגים הונחו עם הפנים מטה על מצע CIM בתוספת אצטוסירינגון. שינוי המשטר הזה הפחית את שיעור האקספלנטים המזוהמים באופן משמעותי, כך שניתן היה לעקוב אחרי הרבה יותר אקספלנטים לאורך כל שלבי הניסויים.
ניסויי טרנספורמציה של 35S::FAD3 במהלך השנה נערכו 7 ניסויים שנועדו לבדוק רגנרציה לאחר טרנספורמציה בהשואה לרגנרציה של נצרונים מתוך פסיגים שלא הודבקו בחידק מותמר,
והתוצאות מובאות בטבלה מספר 5, מספר הפסיגים שהועברו למצע CIM2 הוא מדד לשיעור הפסיגים מהם נראתה התמיינות ברורה של ניצרונים. המספר הנמוך נובע בעיקר מאובדן פסיגים כתוצאה מזיהומים.


טבלה 5: סיכום ניסויי רגנרציה אם וללא טיפול לטרנספורמציה ל- 35S::FAD3


כל הצימחונים שהתמיינו בנוכחות Zeatin השחימו וכמשו לאחר העברתם למצע ההשרשה, הצמחונים שהתמינו במצע שהכיל TDZ המשיכו לגדול אך לא השתרשו במצע ההשרשה. בנסיון לקבל השתרשות נטבל בסיס של 12 מהניצרונים באבקת השרשה ( המכילה את ההורמון IBA) והם הועתקו למצע להנבטת זרעים (תערובת כבול וטוף), אולם לאחר זמן קצר הם כמשו ומתו.
בהמשך שונה הפרוטוקול כך שניצרונים שהתפתחו בנוכחות קנמיצין הועברו למצע CIM שהכיל בנוסף לקנמיצין רק את ההורמון NAA (5mM) העברה למצע זה שיפרה מאד את התארכות וההסתעפות של הניצרונים ואת המופע המורפולוגי שלהם (תמונה 5A,B ) אבל כפי שרואים בלוח 5C בנוכחות קנמיצין חלק מהניצרונים הלבינו לגמרי מה שמעיד שאינם טרנסגניים, ובחלק מהניצרונים, חלק מההסתעפויות הלבינו ומספר עלים נותרו ירוקים מה שנראה על פניו ככימרה, כלומר תערובת של תאים מותמרים ולא מותמרים לטרנסגן. בכל מקרה לא הצלחנו לקבל השתרשות של הניצרונים הללו במצע ההשרשה CIM-IBA .


תמונה 5: השפעת NAA על גדילת ניצרונים בנוכחות קנמיצין. לאחר התמרה ל:
35S::GUS-Intron
A ) ניצרונים שהתמיינו במצע CIM2-TDZ מפסיגים שהודבקו בחידק אגרובקטריום מותמר
B ) התארכות והסתעפות הניצרונים במצע שמכיל את ההורמון NAA ..
C ) הלבנה בחלק מהסתעפויות הניצרונים לאחר שהות יותר ממושכת במצע.


ניסויי טרנספורמציה של 35S::gus-intron
כדי לנסות לאתר את הבעיה המונעת קבלת צמחונים משתרשים מניסויי הטרנספורמציה השונים, נערכו במהלך השנה שבעה ניסויי התמרה של הגן המדווח 35S::gus-intron (שיעורי הרגנרציה בחלק מהניסויים מובאים בטבלה 6) . מכיון שהגן מכיל אינטרון, הוא יכול להתבטא, דהיינו לתת צבע כחול שהוא תוצר פעילות האנזים GUS על הסובסטרט חסר הצבע X-gluc רק אם הגן הועבר מחידק האגרובקטריום אל גרעין התא הצמחי (Vancanneyt et al 1990) . ביטוי חולףביטוי של הגן GUS יתרחש בכל התאים בהם הטרנסגן הועבר לגרעין התא הצמחי, גם אם לא השתלב באופן קבוע בגנום. אולם ביטוי זה יתקיים ימים ספורים בלבד לפני שהטרנסגן שלא השתלב בגנום יהרס (יעוכל ע"י אנזימי (DNAase . לעומת זאת, צביעת GUS חיובית זמן רב לאחר ההדבקה אפשרית רק בתאים בהם הטרנסגן השתלב פיזית לתוך הגנום הצמחי, כלומר רק כאשר אכן התרחשה טרנספורמציה קבועה.


טבלה 6: שיעורי התמיינות ניצרונים בשלושה מניסויי התמרת 35S::GUS-intron


כדי לעקוב אחרי התפתחות תאים מותמרים לגן המדווח GUS במספר ניסויים הוקרבו מקטעי אקספלנטים בפרקי זמן שונים לאחר ההדבקה בחידק המותמר ל- GUS-intron . כפי שרואים בתמונה 6A , ביום הרביעי לאחר ההדגרה עם החידק, בהרבה מהתאים של הפסיגים נראתה פעילות האנזים GUS מה שמוכיח שלפחות התמרה חולפת (חדירה של הטרנסגן לגרעין תאי הצמח), התרחשה בהרבה מאד מתאי הפסיגים המודבקים. בלוח 6B מוצגים פסיגים שבהם נבחנה פעילות הטרנסגן 8 ימים לאחר ההתמרה. כאן רוב הרקמה לבנה (אין ביטוי של הטרנסגן) אך בכל הפסיגים עדין קיימים אזורים מוגדרים וברורים של ביטוי הטרנסגן , אלו מיצגים קרוב לודאי אזורים שמקורם מריבוי תאים שעברו התמרה יציבה. וראשי החץ בתמונה מצביעים על טרנספורמציה יציבה באזור ממנו גם מתמיינים הניצרונים (לוח6C ) . בלוח 6D מוצגים חלקי ניצרונים שנחתכו מתוך ניצרונים ירוקים שעברו התמיינות והסתעפות בנוכחות קנמיצין. מקור הניצרונים במספר ניסויי הדבקה שהתרחשו שבעה עד שמונה שבועות קודם לבדיקה. מתוך 17 מקטעי ניצרונים שנבחנו עד כה, ושמקורם בפסיגים שונים, כלומר בארועי טרנספורמציה שונים, באף אחד לא ראינו הכחלה של הניצרון עצמו, אבל ברובם ראינו הכחלה ברורה באזור הקרוב לבסיס הניצרון (מודגשים בראשי חץ בתמונה) .

 


תמונה 6: צביעת GUS של אקספלנטים וניצרונים שנדגמו בפרקי זמן שונים לאחר ניסויי ההתמרה ב- 35S::GUS-intron . A ) צביעת GUS נראית ברוב תאי הפסיגים 4 ימים לאחר ההדגרה עם החידקים. B ) צביעה רק במספר אזורים מוגדרים בפסיגים 8 ימים לאחר ההדגרה, בראשי חץ מסומנים אזורי צביעת GUS באזור שנראה שממנו מתחילה רגנרציה של ניצרונים.
C ) תמונות של ניצרונים שמתחילים להתמיין מאזור הפטוטרת או בקרבתה. D ) צביעת GUS חיובית רק בתאים שבקרבת בסיס הניצרונים שהתמיינו (מסומנים בראשי חץ) , מקור הצמחונים בניסויי טרנספורמציה שנערכו 7-8 שבועות קודם לצביעה.
דיון, מסקנות והשלכותיהן על המשך ביצוע המחקר:
מאחר והפרוטוקולים שפורסמו בספרות נמצאו בלתי יעילים להשראת רגנרציה וטרנספורמציה בזן התלתן תבור, מירב המאמץ הושקע בפיתוח פרוטוקולים שיאפשרו רגנרציה של צמחים טרנסגניים של זן זה. מהמכלול של עשרות ניסויים שבוצעו במהלך המחקר ניתן לסכם כי השיעור הגבוה ביותר של רגנרציית ניצרונים התקבל מפרוטוקול הכולל:
א) המקור הטוב ביותר של אקספלנטים הם הפסיגים של זרעים מותפחים, פסיגים הכוללים גם מקטע זעיר של הפטוטרת, אבל ללא ניצרון חיקי או קודקודי.
ב) התפחת הזרעים בטמפ' החדר למשך 18-24 שעות לפני טיפול הסטריליזציה, מקטינה התפרצות זיהומים אנדופיטיים הנישאים בזרעים.
ג) הדבקה בחידק בריכוז שבין 0.4-0.5 OD למשך 30 דקות בלבד , והעברת הפסיגים המותמרים למצע חדש כעבור יום. העברה למצע סלקציה- לפחות 48 שע' לאחר ההדבקה.
ד) רגנרציה בשיעור לא מבוטל מתקבלת במצע CIM1-TDZ (ב- 20-40% מהפסיגים).
ה ) העברה למצע עם ריכוז נמוך של IAA ו- TDZ ( מצע ( CIM2-TDZחיונית להמשך הגדילה וההסתעפות של הניצרונים.
ו) העברה למצע המכיל רק את האוקסין הסינטטי NAA (5mM) (שעדיף על האוקסין הטבעי (IAA מאיצה התארכות והסתעפות הניצרונים תוך ימים ספורים.
איתור מקור הבעיה בקבלת ניצרונים טרנסגניים: העובדה שצביעת GUS היתה שלילית בכל 17 הניצרונים שנבחנו, אולם, ברובם עדין נשמרה צביעת GUS בבסיס הרקמה ממנה התפתח הניצרון, או בתאים אחרים בקרבת הניצרון.(תמונה 6D ) מצביעה בברור שחלה טרנספורמציה יציבה, אולם נראה שההתמיינות מתרחשת לא מהתאים שעוברים טרנספורמציה בהצלחה. הקרבה הפיסית בין תאים מותמרים לניצרונים, רומזת, שהתמיינות ניצרונים ירוקים בנוכחות גורם הסלקציה התאפשרה משום שתאים בקרבת מקום פרקו את האנטיביוטיקה ובכך יצרו מיקרו-סביבה שבה ריכוז האנטיביוטיקה נמוך דיו כדי לאפשר לניצרון להתמיין, מסקנה זו נתמכת בממצא שבהמשך התמינות הניצרונים מקבלים ניצרונים מסועפים, חלקם בעלי עלים לבנים-שקופים, מה שמעיד על חשיפה לקנמיצין של תאים הרגישים לו, וחלק מהניצרון ירוק, כנראה בגלל פירוק האנטיביוטיקה ע"י תאים סמוכים.
המלצות להמשך המחקר: למרות שמימון המחקר הסתיים, מכיון שלא הצלחנו עדין לבסס פרוטוקול שלם לרגנרציה של צמחים מותמרים, אנו מציעים לבחן בהמשך את האפשרויות הבאות לקבלת צמחים טרנסגניים:
א) שימוש בפסיגים שיחתכו באמצע, משום שצביעת GUS לאחר שמונה ימים נראתה יותר במרכז הפסיג מאשר בקצה הקרוב לפטוטרת.
ב) הארכת משך זמן ההדגרה עם החידק לפני העברה למצע עם גורם הסלקציה.
ג) ניסוי התמרה בשיטה ביוליסטית של ניצרונים צעירים- למרות החיסרון הברור של השיטה שיכולה להניב במקרה הטוב ביותר צמח כימראלי לטרנסגן. אולם, בהנחה שבחלק מהמקרים הכימרה תכלול תאים שיהוו חחלק מרקמת המוצא לתאי גמטות, ניתן לערוך סלקציה לעמידות לקנמיצין בהנבטת זרעים של צמח שהותמר בשיטה הביוליסטית.
ד) לשקול ניסיון לטרנספורמציה של גמטות , ע"י טבילת פרחים במרק חידקים, בדומה לפרוטוקול הקיים לגבי ארבידופסיס.
ה) הדבקת פרימורדיות שמתפתחות ע"ג הפסיג באגרובקטריום (עיקרון דומה להתמרה ביוליסטית).

 


רשימת ספרות מצוטטת

Bhatnagar-Mathur P, Vadez V, Sharma KK. (2008) Transgenic approaches for abiotic stress tolerance in plants: retrospect and prospects. Plant Cell Rep. 27(3):411-24.. Review.
Bottinger P, Steinmetz A, Schieder O, Pickardt T (2001) Agrobacterium mediated transformation of Vicia faba. Mol Breed 8: 243–254
Ding Y-L, Aldao-Humble G, Ludlow E, Drayton M, Lin Y-H, Nagel J, Dupal M, Zhao G, Pallaghy C, Kalla R, Emmerling M, German Spangenberg G (2003) Efficient plant regeneration and Agrobacterium-mediated transformation in Medicago and Trifolium species. Plant Sci 165(6): 1419-1427
Pickardt T, Meixner M, Schade V, Schieder O (1991) Transformation of V. narbonensis via Agrobacterium-mediated gene transfer. Plant Cell Rep 9: 535–538
Shao HB, Chu LY, Jaleel CA, Manivannan P, Panneerselvam R, Shao MA. (2009) Understanding water deficit stress-induced changes in the basic metabolism of higher plants - biotechnologically and sustainably improving agriculture and the ecoenvironment in arid regions of the globe. Crit Rev Biotechnol.;29(2):131-151. Review
Somers DA, Samac DA, Olhoft PM. Recent advances in legume transformation. Plant Physiol. 2003 Mar;131(3):892-9. Review.
Sullivan ML, Quesenberry KH (2006) Red Clover (Trifolium pratense ). In: Methods in Molecular Biology, Agrobacterium protocols, 2/e, vol1 (Ed. Wang K), Humana Press, pp. 369-384.
Umezawa T, Fujita M, Fujita Y, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K. (2006 ) Engineering drought tolerance in plants: discovering and tailoring genes to unlock the future. Curr Opin Biotechnol. 17(2):113-122.. Review.
Vancanneyt, G.; O’Conner-Sanchez, A.; Willmitzer, L.; Rocha-Sosa, M. (1990) Construction of an intron-containing marker gene: splicing of the intron in transgenic plants and its use in monitoring early events in Agrobacterium-mediated plant transformation. Mol. Gen. Genet. 220: 245-250.
Zhang M, Barg R, Yin M, Gueta-Dahan Y, Leikin-Frenkel A, Salts Y, Shabtai S, Ben-Hayyim G. . (2005) Modulated fatty acid desaturation via overexpression of two distinct omega-3 desaturases differentially alters tolerance to various abiotic stresses in transgenic tobacco cells and plants. Plant J 44(3):361-371.

פירסומים:∗
גרינברג ב. ומורוחובסקי מ. (2006) פרוייקט גמר במסלול הנדסאי ביוטכנולוגיה, המיכללה למינהל ראשל"צ, בנושא: התאמת מערכת טרנספורמציה לצמחי קיטניות.
טריוחן א. . (2007) פרוייקט גמר במסלול הנדסאי ביוטכנולוגיה, המיכללה למינהל ראשל"צ, בנושא: פיתוח מערכת רגנרציה לצמח תלתן אלכסנדרוני. (2007) גרינברג ביאנה ומורוחובסקי מרינה
טוויג א, ושולמן א. . (2008) פרוייקט גמר, בית הספר להנדסאים, המכללה האזורית יהודה ושומרון, אריאל, בנושא: פיתוח מערכת טרנספורמציה גנטית בתלתן אלכסנדרוני ו כאמצעי לשיפור הסבילות לתנאי יובש.
איריס רויזין (2009) פרוייקט גמר, ללימודי הנדסאי ביוכנולוגיה, המכללת לטכנאים ולהנדסאים, עמל ב' ,פתח-תקוה. בנושא: פיתוח מערכת טרנספורמציה בתלתן אלכסנדרוני.
∗ כל הפרויקטים בהדרכת ר. ברג וש. שבתאי.

 


3. סיכום עם שאלות מנחות
נא להתייחס לכל השאלות בקצרה ולעניין), ב 3- עד 4 שורות לכל שאלה (לא תובא בחשבון חריגה מגבולות
המסגרת המודפסת.


מטרות המחקר תוך התייחסות לתוכנית העבודה.
לבחון האם שינוי ברמת הדה-סטורציה של החומצות השומניות על ידי ביטוי ביתר של הגן fad3 (35S::FAD3) עשוי להגביר באופן משמעותי את הסבילות לעקת יובש במיני קיטניות. בפועל המטרה העיקרית היתה להעמיד מערכת טרנספורמציה בתלתן אלכסנדרוני, בזןהישראלי "תבור"


עיקרי הניסויים והתוצאות.
נבדקו מקורות שונים של אקספלנטים להתמרה ונמצא שפסיגים שחולצו מזרעים מותפחים הכוללים מקטע של הפטוטרת, הם המתאימים ביותר. נבדקו הרכבים הורמונאליים שונים להשראת התמיינות ונמצא הפרוטוקול שנותן את ההתמינות הטובה ביותר לניצרונים, כויל משטר ההדבקה בחידקי האגרובקטריום, בדיקת ביטוי הגן GUS-intron מצביעה על טרנספורמציה יציבה, רק באזורים סמוכים לניצרונים אבל לא בניצרון עצמו.


מסקנות מדעיות וההשלכות לגבי יישום המחקר והמשכו. האם הושגו מטרות המחקר לתקופת הדוח?


מטרת המחקר המקורית לא הושגה משום שהפרוטוקולים שפורסמו בספרות להתמרת מיני קיטניות קרובים, לא מתאימים לתלתן מזן "תבור". מהממצא שהתמיינות ניצרונים לא מתרחשת מהתאים המותמרים אלא מתאים סמוכים, עולה שיש לשנות את שיטת הטרנספורמציה. מספר אפשרויות כיצד לנסות לעשות זאת פורטו בדיון בוף הדו"ח.


בעיות שנותרו לפתרון ו/או שינויים (טכנולוגיים, שיווקיים ואחרים) שחלו במהלך העבודה; התייחסות המשך המחקר לגביהן, האם יושגו מטרות המחקר בתקופה שנותרה לביצוע תוכנית המחקר?


בחינת שיטות אחרות לטרנספורמציה, ניסיון להשרות רגנרציה מאמצע הפסיג ולא מאזור הפטוטרת.


הפצת הידע שנוצר בתקופת הדו"ח: פרסומים בכתב - ציטט ביבליוגרפי כמקובל בפרסום מאמר מדעי;
פטנטים - יש לציין שם ומס' פטנט; הרצאות וימי עיון - יש לפרט מקום, תאריך, ציטוט ביבליוגרפי של התקציר, כמקובל בפרסום מאמר מדעי.


בשלב זה הידע נכלל רק בפרויקטים של עבודות גמר של סטודנטים במכללות להנדסאים, כפי שצויין בגוף הדו"ח.

 


לכל המבזקים....
office@milk.org.il פקס: 972-3-9564766 טל: 972-3-9564750 דרך החורש 4 , ת"ד 97, יהוד 5647003
מופעל באמצעות מעוף - מגוון אפקט