אפיון גן עיקרי לבקע טבורי בבקר
תקציר

בקע טבורי היינו פגם התפתחותי, המונע איחוי אזור פתח הטבור, בסיום השלב העוברי. השכיחות הממוצעת לבקע הטבור בבקר מגזע הולשטיין היא 1%. צאצאי הפר הקנדי אנהנסר, שיובא לישראל לצורך השבחת הגזע, הראו שכיחות גבוהה מהרגיל של מקרי בקע טבורי בצאצאים.  עשרה בנים של אנהנסר הראו שכיחות של 1%-21% של בקע טבורי, בצאצאיהם הישראלים. תוצאות אלה תואמות מודל גנטי בו אנהנסר הוא הטרוזיגוט לגן דומיננטי לבקע טבורי, עם חודרנות חלקית.

על מנת למפות את אזור הגן, נערכה סריקה של הגנום בעזרת סמנים מיקרוסטליטים, והגן מופה לכרומוזום 8 במרחק 3 יחידות מיפוי מהצנטרומר, במרווח ביטחון של 8 יחידות מפה. מניתוח כל הנתונים מתקבל שההסתברות לטעות באיתור הגן היא 0.0001. 

על ידי מיפוי השוואתי עם אדם, נבנתה מפת שעתוק של האזור על מנת לאתר גנים מועמדים לבקע טבורי, ואכן נמצא גן מועמד, GATA4  המהוה חלק ממסלול בקרתי, ששיתוק שלו גרם להופעת בקע טבורי בעכברים. בודד פלסמיד גנומי (BAC) ונקבע רצף של 170,000בסיסים באזור הגנומי של הגן 4 .GATAעל פי מידע זה בודדו 4 אקסונים מתוך ה-6 של הגן אך לא אותרו מוטציות באקסונים אלה. על פי הרצף הגנומי שאפיינו בודדו 3 סמנים מיקרוסטליטיים, וסמן SNP באזור מרווח הביטחון. מעקב אחר אופן הורשתם איפשר צמצום מרווח זה, ושלילת המועמדות של הגן  GATA4.

תוצאות המחקר התפרסמו במאמר "בקע טבורי בבקר מופה בקצה הצנטרומרי של כרומוזום 8 של בקר" רון ושות' Anim. Genet. 35:431-437 (2004).

1. רקע מדעי
בקע טבורי היינו פגם אשר מתבטא בפתח טבורי אשר אינו נסגר כראוי במהלך השלב העוברי.  בקע טבורי מופיע במספר גזעים של בקר, כולל גזע הולשטיין, אך אינו מופיע בגזעים אנגוס והרדפורד (Hayes, 1974).  פגם זה מאובחן בין היום השמיני ליום העשרים לאחר לידת העגל, והוא כולל מספר דרגות של חומרה. גודל הבקע נע בין בקע קטן מאוד, 1.5 ס"מ, ועד לפתח גדול של 8-10 ס"מ, ונהוג לאפיין אותו במספר אצבעות. ניתן לחוש בבקע הטבור באמצעות מישוש של נפיחות תת עורית בולטת באזור הטבור. בקע טבורי נראה בבקר בתדירות גבוהה יותר בנקבות מאשר בזכרים. במחקר שנעשה על 2045 עגלים ועגלות מגזע הולשטיין - 1% מהעגלות ו- 0.5% מהזכרים הראו בקע טבורי. ההפסד הכלכלי מוערך במאות דולרים עבור ניתוח כירורגי.  מאנליזה של נתוני בריאות (Brem, 2000) מספר-העדר נמצא ששכיחות של עצירת שלייה בפרות מתחלובה ראשונה גדל מ-7% ללא בקע טבורי ל-18% עם בקע (p<.001). בנוסף לכך, שכיחות הקוד הרפואי "בעיות המלטה אחרות" הייתה גבוהה פי 6 בקבוצת הפרות עם בקע בהשוואה לפרות ללא בקע (p<.001).  מספר הצעות הועלו לגבי הסיבות לבקע טבורי, ביניהן: מקריות, בעיות במערכת העיכול, לחץ, חולשת שרירים ותורשה (Warren and Atkeson, 1931). בקע טבורי נחשד כתורשתי במספר מינים. למשל בכלבים (Phillips and Felton,1939), בגזע הקוקר ספנייל נמצאה תדירות בקע טבורי של 12%. בחזירים, לאחר 3 דורות של סלקציה, העלו את תדירות בקע  הטבור מ- 7.5% ל-43% (Warwick, 1926).

פרות מצטיינות בישראל הוזרעו על ידי זירמת הפר הקנדי אנהנסר ליצירת 12 עגלים. שישה מהם נולדו עם בקע טבורי.  10 עגלים, מהם 4 עם בקע, הזריעו פרות ישראליות וחושב להם מבחן צאצאים.  שכיחות בקע בצאצאים של כל בן נעה מ-1% עד 21% והייתה גבוהה מ-10% ל-4 בנים, כאשר ממוצע בקע טבורי באוכלוסייה הוא 1%.  אלויס, בן אנהנסר, חזר להזרעה לאחר מבחן-צאצאים והיו לו 432 פרות בתחלובה עם 11.3% בקע.   תוצאות אלו היו בהתאמה להשערה שאנהנסר הוא הטרוזיגוט לגן עיקרי עם חודרנות חלקית לבקע טבורי. מספר מחקרים הראו שגנים למחלות עם חודרנות חלקית ניתנים למיפוי על ידי סמנים גנטיים מתפצלים.  רב הגנים למחלות אותרו באדם על ידי אנליזה של זוגות אחים חולים.  כיון שמשפחות אדם הן קטנות, זה נדיר למצוא יותר מ-2 עד 3 פרטים חולים בתוך מבנה משפחתי.  לכן, יש לבצע אנליזה של מספר רב של משפחות כדי להשיג עוצמה סטטיסטית לאיתור גן למחלה. באדם ידוע על 1172 מוטציות בגנים הגורמות לפגמים גנטיים. ההנחה היא כי גם לבקר מספר דומה, אולם רק כמה עשרות תוארו. בבקר קיימות משפחות חצאי-אחים גדולות לאנליזה. כ-15 גנים למחלות מופו בבקר לחלב, אך רובם היו גנים רצסיביים עם חודרנות כמעט מלאה.  אנחנו לא מודעים לדוגמאות של מיפוי גנים דומיננטיים עם חודרנות חלקית בבעלי-חיים.

במחקר  שנערך בעבר במחלקתנו נאספו דם ושיער של 42 צאצאים של הפר אלויס עם בקע טבורי ו-77 פרות ללא בקע.  כמו כן, הופק דנ"א מזרמה של 7 בנים נוספים של הפר אנהנסר.  סמנים גנטיים נבחרו על פי מידת הפיזור במפה של בקר (איור 1).  אנליזה של סמנים גנטיים בוצעה על רצף דנא אוטומטי.  אנליזה סטטיסטית השוותה בין שכיחות אלל אבהי בקבוצת הבקע לעומת קבוצת הפרות ללא בקע.  התקבלו תוצאות מובהקות בשכיחות אלל אבהי של הפר אלויס ל-3 סמנים גנטיים מתוך 59 בין קבוצת הבקע לעומת הביקורת.  האלל האבהי השכיח בקבוצת הבקע של צאצאי אלויס לכל אחד מ-3 הסמנים נבדק בפר אנהנסר.  התקבל שרק בסמן הנמצא על כרומוזום 8 האלל הקשור לבקע עבר בתורשה מאנהנסר. בשני הסמנים האחרים התוצאה בצאצאי הפר אלויס התקבלה במקרה והיא צפויה למקרה שבו מבצעים מספר רב (59) של השוואות סטטיסטיות.

 

 איור 1 סריקה גנומית למפוי הגן לבקע טבורי בבקר. חיצים מציינים את העמדה היחסית של הסמנים הגנטיים לאורך הכרומוזומים. חץ מודגש מצביע לעמדה של הסמן על כרומוזום 8. סמן זה הראה תאחיזה לגן הבקע הטבורי.

 

ארבעה סמנים גנטיים נוספים נבדקו באזור הצנטרומרי של כרומוזום 8 בבקר.  נמצא קשר מובהק בין בקע טבורי ואלל אבהי לכל אחד מהסמנים במובהקות של 0.001.  עקומת הצפיפות של מיקום הגן מוצגת באיור 2.  המיקום החזוי של הגן הוא בשיא העקומה שהיא 3 יחידות מפה מהצנטרומר של כרומוזום 8 בבקר בתוך מרווח ביטחון של 10 יחידות מפה.

 

 איור 2. עקומת הצפיפות של מיקום הגן לבקע טבורי. חצים מסמנים את מיקום שני הסמנים UWCA47 ו- RM321/ BM3419 מבין 4 הסמנים ששמשו למיפוי עדין של גן זה.

 

בוצע מיפוי גנטי השוואתי בין האזור הצנטרומרי של כרומוזום 8 בבקר והאזור ההומולוגי לו באדם. הורכבה מפה של 15 גנים באדם בתוך מרווח המטרה של 10 יחידות מיפוי בבקר.  אחד מגנים אלו, Gata4, הוא חלק ממסלול שעתוק שפגיעה בו, על ידי שיתוק (knockout) אחד הגנים המעורבים, הובילה לבקע טבורי מולד בעכברים.  לפיכך, גן זה הוא מועמד עיקרי לגן הבקע. בעזרת היברידיזציה של תוצר PCR של גן זה, לפילטרים עליהם הוטבע מערך של ספריית כרומוזומים מלאכותיים של בקר (BACs) בודדו שישה שבטים. תכולת הגנים בשבטים אלה נבדקה ואומתה ההשערה שקיימת הומולוגיה מלאה באזור בין אדם לבקר. אחד משבטים אלה (rp42-513g13) נבחר לקביעת רצף רחבת היקף, במסגרת שתוף פעולה עם מרכז ריצוף בארה"ב. ניתן לעקוב אחר התקדמות הפרוייקט ב-http://www.genome.ou.edu/other_vertebrates_totals.html.  תכנון פריימרים של PCR, ע"פ הרצף שיקבע, יאפשר סריקה של הגנים המועמדים לנוכחות המוטציה האחראית לבקע הטבור.

2. מטרות וחשיבות המחקר

מטרת מחקר זה היא לזהות את גן עיקרי המוביל לבקע טבורי בבקר ופיתוח סמנים גנטיים שיאפשרו איתור של נשאי גן זה.

3. תוצאות

תכנית המחקר משלבת שתי גישות: 1- גישת הגן המועמד ו-2 שיבוט לפי מיקום, המבוסס על מיפוי גנטי עדין. גם אם לא אותרה המוטציה המובילה לבקע הטבור באנליזה של גן מועמד, סביר שיתגלו בו במהלכה סמנים פולימורפיים מסוג SNP. סמנים אלה יכולים להועיל למיפוי העדין. האיזון בהשקעת המשאבים בין שתי הגישות נקבע בהתאם לתוצאות המושגות במהלך המחקר.

 

3.1 זיהוי של גנים מועמדים לשאת את המוטציה המובילה לבקע הטבור בעזרת מיפוי השוואתי של בקר, אדם ועכבר וניתוח תוצאות ריצוף BAC מכרומוזום 8 של בקר.

שיבוט לפי מיקום תלוי במידע מדויק על אזור כרומוזום 8 של בקר, אליו מופתה המחלה. המפות הגנומיות של אדם ועכבר, המבוססות על מחקר מפותח בהרבה מזה שקיים בבקר, יכולות לספק את המידע המבוקש. צפיפות הסמנים הגנטיים באזור הנדון אפשרה למקם את הגן האחראי לבקע לאזור הנמצא כשלש יחידות מפה מהצנטרומר עם מרווח ביטחון של עשר יחידות מפה (Ron et al., 2000). הגן קתפסין (Cathepsin B, CTSB) של בקר, שידוע כי הוא ממוקם באזור המטרה בכרומוזום, משמש כנקודת יחוס ללמוד הגנים האורתולוגים באדם.  ניתן לצפות במיפוי של גנים אלה בעזרת דפדפנים גנומיים כגון זה של סנטה קרוז (http://genome.cse.ucsc.edu). סיום הריצוף של הפלסמיד הגנומי שבודדנו (באיור 3) אימת כי הגן המועמד Gata4 נמצא על כרומוזום 8 בסמוך ל- Ctsb, ושרצף הגנים באזור שמור בין בקר לאדם.

 

 

איור 3. השוואה של רצף ה- BAC AC107065 של בקר לרצף הגנומי של אדם בעזרת התוכנה GAP4

רצף הנוקלאוטידים של ה- BAC שבודדנו הושווה לזה של האדם בעזרת איתור רצפים זהים בני 15 בסיסים (נקודות באדום).  שמות 4 הגנים הנכללים בפלסמיד מצוינים ליד מקבצי הרצפים השמורים שאותרו. בצירים מופיעות סכמות של האזורים המושווים ועליהן סימונים של האלמנטים הגנומים השונים. ירוק- אלמנטים חוזרניים, אדום- מיקרוסטליטים, צהוב- פריימרים שתוכננו, כתום- אקסונים של הגן GATA4 (בבקר) וכל הגנים באדם. תכול- אקסונים של הגנים Neil2 ו- Fdft1 בבקר. וורוד- אקסונים של הגן Ctsb.

 

 

 

איור 4. אתור מוטציות וסמנים פולימורפיים בגן GATA4.

ע"פ הרצף הגנומי תוכננו פריימרים ל- PCR סביב אקסונים של הגן GATA4. תוצרי הראקציה שובטו ונבחרו 10 תת-שבטים לקביעת הרצף. בתמונה מוצגות תוצאות עבור אקסון 4. הקטע האמור נמצא בסופו של אינטרון 3 בו תוכנן הפריימר הראשון (צהוב). הקטע כולל אזור של מיקרוסטליט מסוג חזרות CA (אדום). אותרו 3 מוטציות (כתום) שונות בשבטים, אך משום שאינן חוזרות על עצמן הן ככל הנראה ארטיפקט של תהליך השיבוט. פולימורפיזם אמיתי צפוי להימצא במחצית השבטים בהתאם לשכיחותו בדנ"א המופק מהפר. בתחתית התמונה מופיעות כרומטוגרמות של 6 מהשבטים שמייצגות כ- 12 נוקלאוטידים מהאזור בו נמצא הסמן (שחור).

 

 

3.2 מיפוי עדין בעזרת מיקרוסטליטים

קביעת רצף רחבת ההיקף אפשרה זיהוי של רצפים חוזרניים כגון חזרות CA. הוכנו פריימרים ספציפיים ל-3 מיקרוסטליטים (איור 5). נערך מיפוי גנטי בעזרת סמנים נוספים אלה על בסיס של דגימת צאצאים של הפרים אלוויס ובנים נוספים של אנהנסר. כל הסמנים שאותרו באזור היו הומוזיגוטים באלוויס ולכן לא תרמו משמעותית למיפוי הגן. תוצאות עבור שנים מהסמנים האלה התפרסמו ב-  Animal Genetics במאמר:

A. Plis-Finarov, H. Hudson, B. Roe, M. Ron, E. Seroussi.

Mapping of the GATA4, NEIL2, FDFT1 genes and CTSB-associated microsatellites to the centrommeric region of BTA8. Anim. Genet.. 35, 154-155

 

 

איור 5. Map of the centromeric end of BTA8 given in centimorgans. On the right, the CTSB region is expanded to include schematic delineation and transcriptional orientation of genes located in the 176-kb BAC AC107065.  The exons for each of the genes are marked as black boxes left to the arrows that show their transcriptional orientations. Locations of genetic markers within this BAC are indicated on the left of the BAC delineation.

 

 

3.3 איתור מוטציות ו- SNPs בגן  מעמד GATA4.

קביעת רצף רחבת ההיקף אפשרה תכנון פריימרים ספציפיים לבדיקת 3 אקסונים מעמדים 4, 5, ו-6 שנמצאו בפלסמיד הגנומי. בעזרת PCR בין אקסונים התקבל הרצף החסר של אינטרונים 3 ו-2 והותאמו פריימרים לבדיקת אקסון 3. תוצרי הראקציות האמורות שובטו בעזרת וקטור (AT-cloning vector). עבור ארבעת האקסונים, והושווה הרצף של עשרה קלונים שמקורם בפר אלוויס או אנהנסר במטרה לאתר מוטציות או סמני SNPs  (איור 4). יתר על כן, שני אזורים חוזרניים מסוג חזרות GT/CA באינטרונים של   GATA4הציגו מופע  הומוזיגוטי בדומה לסמנים האחרים (ראה סימון אדום באיור 4). הדבר מצביע על כך שהאללים באזור גן זה מקורם מהורה קדום זהה ולכן לא צפוי מופע דומיננטי של המחלה כתוצאה מפגם בגן.

 

3.3 איתור SNPs באזור הצנטרומרי של ה- BAC

כדי ליצר סמן אינפורמטיבי באזור המטרה לפר אלוויס החלטנו להתרכז בקצה הצנטרומרי של ה- BAC מעבר לגן  CTSB(ראה איור 5). איתרנו אלמנט גנומי שהשתמר בין אדם ובקר וקבענו את הרצף שלו בפר אלוויס. במקטע קצר זה (813 זוגות בסיסים) התגלו 8 סמני SNP שיצגו שני אללים להם הפר אלוויס היה הטרוזיגוט. בעזרת סמן זה ניתן היה להוכיח סופית כי הגן GATA4 אינו יכול להיות האחראי לתופעת הבקע הטבורי. המשך החיפוש אחר הגן התנהל באזור שבין הצנטרומר לגן  CTSB(ראה איור 6). תוצאות המחקר התפרסמו ב-  Animal Genetics במאמר רצ"ב:

Ron M, Tager-Cohen I, Feldmesser E, Ezra E, Kalay D, Roe B, Seroussi E, Weller JI. (2004) Bovine umbilical hernia maps to the centromeric end of Bos taurus autosome 8. Animal Genet. 35, 431-437

 

 

איור 6.  The haplotypes of the sons of Enhancer for nine markers spanning the centromeric end of BTA8, and the LOD score profile for the UH gene map location.  The + Enhancer haplotype in Enhancer and his sons is denoted in dark grey, while the UH haplotype is denoted in light grey.  Maternal haplotypes of the sons are in white.  The locations of markers UWCA47, SRC276, RM321, BM3419, RM372, and BMS1591 are denoted by arrows with cM distances from the centromere. Other markers not genotyped in progeny of sire 3259 are indicated with locations derived from other linkage maps.  Haplotype assignment is based on the assumption of no double recombinations, informativity of the marker and the results of the progeny tests.  Unequivocal assignment of alleles to haplotypes are denoted by numbers in bold font. Putative assignments of alleles to haplotypes assuming no recombination are denoted by numbers in normal font.  Single recombinations are shown for sires 3186 and 3259 with the latter inferred from the progeny test results.  The LOD score profile for the daughters of sire 3259 is given on the right.  LOD scores are given relative to the likelihood obtained without marker information.

 

5. מובאות

 Brem, E. (2000) Etiology and genetic background of cattle's umbilical hernia. Thesis for D.V.M. Hebrew University, Rehovot, pp. 32.

 Hayes, H.M. (1974) Congenital umbilical and inguinal hernias in cattle, horses, swine, dogs and cats: risk by breed and sex among hospital patients. Amer J of Vet Res, 35, 839-842.

 Phillips, J.M. and Felton, T.M. (1939) Hereditary umbilical hernia in dogs. J of Heredity, 30, 433-435.

 A. Plis-Finarov, H. Hudson, B. Roe, M. Ron, E. Seroussi. (2004) Mapping of the GATA4, NEIL2, FDFT1 genes and CTSB-associated microsatellites to the centrommeric region of BTA8. Anim. Genet., . 35, 154-155

 Quackenbush, J., Liang, F., Holt, I., Pertea, G. and Upton, J. (2000) The TIGR gene indices: reconstruction and representation of expressed gene sequences. Nucleic Acids Res, 28, 141-5.

 Ron, M., Tager, I., Feldmesser, E. and Weller, J.I. (2000) Genome scan for umbilical hernia in cattle. Internaional Conference of Animal Genetics, Minnesota.

 Ron M, Tager-Cohen I, Feldmesser E, Ezra E, Kalay D, Roe B, Seroussi E, Weller JI. (2004) Bovine umbilical hernia maps to the centromeric end of Bos taurus autosome 8. Animal Genet. 35, 431-437

 Warren, W., Smith, T.P.L.,Rexroad C.E., Fahrenkrug S.C.F., Allison T., Shu C.L., Catanese J., de Jong P.J. (2000) Construction and characterization of a new bovine bacterial artificial chromosome library with 10 genome-equivalent coverage. Mammalian genome, 11, 662-663.

 Warwick, B.L. (1926) Wis. Agr. Expt. Sta. Res. Bulletin, 69.

לכל המבזקים....
office@milk.org.il פקס: 972-3-9564766 טל: 972-3-9564750 דרך החורש 4 , ת"ד 97, יהוד 5647003
מופעל באמצעות מעוף - מגוון אפקט