תוכנית מס' 847-0326-05


יישום שיטות מולקולריות (PCR) לזיהוי נשאות מיקופלסמה אגלקטיה בצאן


ש. לויזון, א. ליסנינסקי, ש. זמיר


תקציב: 40000 ₪, דו"ח סופי

 

תקציר
אגלקטיה מדבקת הינה מחלת צאן המתבטאת בירידה קשה בתנובת החלב, דלקת פרקים, דלקת ריאות ודלקת עיניים ואף תמותה, בעיקר בוולדות. המחלה נגרמת ע"י כמה מיני מיקופלסמה כשהנפוץ בהם, והיחיד שנמצא בכבשים, הוא מיקופלסמה אגלקטיה (MA). חיידק זה אנדמי בארץ ובאזורים אחרים הגובלים בים התיכון. אחד המאפיינים של הדבקה ב- MA הינו היכולת להימצא בבעל חיים נגוע לאורך זמן ללא סימנים קליניים, הן לפני הופעת המחלה והן לאחר אירוע קליני (convalescent animals). מאפיין נוסף הוא יכולת החיידק לשרוד בנוכחות נוגדנים נגדו. בע"ח נשאי MA מהווים מקור הדבקה בתוך העדר או הדבקה במהלך העברה מסחרית מעדר לעדר. גילוי MA בבע"ח נשאים מהווה אתגר מיוחד וזאת בגלל השיעור הנמוך של החיידקים והפרשתם הספוראדית בחלב במהלך הדבקה כרונית. במחקר זה בחנו את האפשרות לשלב מבחני PCR במערך הניטור של MA. השוונו את הרגישות והסגוליות של שלושה מבחני PCR לזיהוי MA. מבחן ה- MAB pol-PCR נראה מתאים לזיהוי MA בדגימות מחומר קליני כמו הפרשות אוזניים ואף, אבל אימות המבחן עם דגימות מעדרים נגועים לא התאפשר. לעומת זאת, רגישות מבחני PCR לאבחון MA בחלב הייתה נמוכה מזאת הנחוצה לאבחון בחומר זה. לפיכך שימוש בטכניקת ה-PCR איננו מהווה חלופה לבידוד בניטור MA בחלב. לעומת זאת, שימוש במבחן ה- MAB pol-PCR יכול לקצר את הזמן הדרוש לאבחון מדויק של בידודי מיקופלסמה מצאן, בפרט במקרים של הדבקה מעורבת בכמה מחוללי מחלה. יישום השיטה למטרת ניטור בבע"ח ללא סימני מחלה לא נבחן כנדרש בגלל חוסר בחומר קליני מתאים.


מבוא ורקע מדעי:
אגלקטיה מדבקת (CA) הינה מחלת צאן הנגרמת ע"י כמה מיני מיקופלסמה, כשהנפוץ בהם הוא מיקופלסמה אגלקטיה MA)). חיידק זה אנדמי בארץ ובאזורים אחרים הגובלים בים התיכון (15,3). בישראל הגורם המוכר היחיד ל- CA בכבשים הינו MA. אך בעיזים קיימים מינים אחרים של מיקופלסמה שאינם מוכרים בכבשים הגורמים למחלת ה- CA, כגון M. mycoides capri , M. mycoides mycoides LC, ו- ssp.capricolum M. capricolum. יחד עם זאת, MA הוא עדיין המחולל העיקרי של מחלת CA בעיזים, והסימנים הקליניים בדרך כלל חריפים מאלה המופעים בכבשים. במהלך השנים 1990 עד 1997 נרשמו כ- 68 אירועי CA בעדרי צאן בארץ, כמחציתם בעדרי עיזים, שיעור הגבוה מחלקם במשק הצאן. נתונים עדכניים אינם נגישים ליחידת המיקופלסמה במכון, ובכל ניסיון לשלוף מידע מדויק ממאגרי המידע מתקבלת תמונה חלקית בלבד, הן לגבי מספר האירועים שאובחנו והן לגבי המקרים שלא הגיעו לאבחון בגלל סיבה כלשהי.
מחלת ה- CA יכולה להתבטא בירידה קשה בתנובת החלב, דלקת פרקים ,דלקת ריאות או דלקת עיניים ואף תמותה, בעיקר בוולדות (15,3). אחד המאפיינים של הדבקה ב- MA הינו המצאות החיידק בבע"ח נגוע לאורך זמן ללא סימנים קליניים. חשיבות הנשאות באפידמיולוגיה של MA הינה בשני מישורים:
א. הדבקה ללא סימני מחלה (טרום קלינית). מצב זה יכול להימשך זמן רב בהעדר עקה שתביא להתפרצות והתבטאות קלינית. במצב זה לא צפויה הפרשת החיידק בחלב ואין יצירת נוגדנים.
ב. הדבקה כרונית לאחר מחלה, ללא סימנים קליניים. בע"ח חיוביים בבדיקות סרולוגיות עלולים להפריש את חיידק המיקופלסמה בחלב, לפחות באופן ספוראדי(12) .
עד לאחרונה שיטת האבחון העיקרית וכמעט בלעדית ל-MA הייתה בידוד החיידק וזיהוי מבדיל של המין ע"י נוגדנים ספציפיים (3). קל לבודדו מחלב שנלקח מחיה החולה במחלת CA קלינית, והחיידק צומח בתנאים סטנדרטיים לגידול מיקופלסמה, הן בזריעה ישירה והן בהעשרה. להבדיל, אבחון נוכחות MA בשיטת הבידוד בחיות שאינן חולבות, או שאינן מראות סימני מחלה הינו קשה. סוגיה נוספת היא זיהוי MA בהדבקה מעורבת עם מיני מיקופלסמות אחרים שעלולים לצמוח מהר יותר בתרבית בידוד. כלי עזר להערכת מצב נגיעות של עדרי צאן הינו בדיקה סרולוגית בשיטת ELISA בערכה מסחרית. חשוב לזכור שמבחן סרולוגי כמו ELISA אינו מבחן פרטני שיכול לאשר או לשלול נוכחות MA בבהמה ספציפית. ידוע שחיידק ה-MA יכול לשרוד בבע"ח בנוכחות נוגדנים כנגדו אבל אין מידע לגבי משך הישרדות הנוגדנים בבע"ח לאחר "העלמות" של MA.
גילוי MA בבע"ח נשאים מהווה אתגר מיוחד וזאת בגלל השיעור הנמוך יחסית של החיידקים והפרשתם הספוראדית בחלב במהלך הדבקה כרונית. ידוע מהספרות ומהניסיון במעבדתנו בעבר שניתן לבודד מיקופלסמה מהפרשות האוזניים בעיזים (תוצאות שלא פורסמו;5,6,8) . הפרשות אלה יכולות להוות מאגר למיקופלסמה, הן של מינים פתוגניים והן של מינים שנחשבים לספרופיטים. בגלל ריבוי מיני המיקופלסמה וחיידקים אחרים, בדיקה של חומר זה בשיטת בידוד סטנדרטית אינה מתאימה. שימוש בשיטות חלופיות שהוצעו בתוכנית מחקר זו אמור להוות פתרון יעיל ומהיר יותר למעקב אחר נוכחות מיקופלסמה.
לאחרונה פותחו שיטות מולקולאריות (PCR) רגישות וספציפיות לזיהוי מחוללי מחלה רבים, הכוללים את מרבית מיני המיקופלסמה הפתוגנים לאדם ולחי. ללא ספק, טכניקת ה-PCR יכולה לקדם את נושא האבחון של נוכחות MA. אף על פי כן, יש מקום להתייחס למספר נקודות קרדינאליות לפני ההחלטה לשלב PCR במערך האבחון.
- מה היא מטרת השימוש ב-PCR במערך האבחון? האם הכוונה היא לקצר את זמן הבדיקה? האם ניתן לאפשר בעזרת שיטה זו זיהוי מדויק של מחולל המחלה בהיעדר שיטה חלופית? האם שימוש בשיטת PCR ספציפית יאפשר זיהוי MA בהדבקה מעורבת עם מיני מיקופלסמות אחרות ו/או חיידקים אחרים?
- מתוך מבחר שיטות ה-PCR ל-MA יש צורך לבחור את המבחן המתאים ביותר מבחינת
סגוליות ורגישות. יש לקחת בחשבון את התכונות המיוחדות של חיידק ה-MA וההשלכות על האבחון: א) הקרבה הגנומית בין MA ו-(MB) Mycoplasma bovis והתגובות המוצלבות ביניהם; ב) האפשרות לשונות גנטית של גן המטרה בקרב זני MA. במחקרים שפורסמו לאחרונה מסתבר שמבחנים שפותחו על בסיס זני יחוס בלבד או נבדקו רק עם בידודים מאזור מסוים אינם תמיד תקפים לגבי זנים מאזורים אחרים (7,13).
- האם המבחן האבחוני אומת (validated), ואם כן, עבור איזה חומר לבדיקה (משטחי אף, חלב או אחר). מה שיטת עבוד הדגימות והפקת דנ"א? יש לציין שמרבית אם לא כל הערכות המסחריות ל- MA-PCR אינן מאושרות לשימוש אבחוני, כפי שמצוין בהוראות היצרן בבירור "Not validated for diagnostic use" או "For research purposes only".


מטרת המחקר:
במחקר זה אנו מציעים לבחון שימוש בטכניקת PCR ככלי עזר במערך האבחון והניטור של MA בצאן. כשלב ראשון התייחסנו לסוגיות השונות בבחירת מבחן MA-PCR מתאים לצרכים של המערכת. שימוש ב-PCR לגילוי MA בבע"ח נגועים או החשודים כנשאים. שיטת ה-PCR תהווה כלי לזיהוי נשאי MA כחלק ממערך הניטור של MA בצאן. ביישום שיטת PCR למטרת בדיקה בבע"ח ללא סימני מחלה (נשאים) נתמקד בדגימות של הפרשות האף והאוזניים, איברים הידועים כמאגרי מיקופלסמה בצאן.


הפעלת המחקר, לפי שלבי הביצוע:
א. בדיקת תקיפות מבחני ה- PCR המוצעים.
בדיקת הרגישות והסגוליות של שלוש מערכות MA-PCR כנגד ריכוזים שונים של דנ"א מזן יחוס ובידודי שדה של MA ודנ"א שהופק ממינים שונים של מיקופלסמה של צאן ובקר. המערכות שנבחנו הן כדלקמן:
- מבחן המבוסס על תחלים Mag F/R המזהים רצף נוקליאוטידים בגן ה- (2,11)16S rRNA הן ב-MA והן ב-M. bovis (MB), שהוא פתוגן של בקר. מבחן זה לזיהוי MB נמצא בשימוש במעבדתנו כבר מספר שנים. ניתן להבדיל בין שני מיני המיקופלסמה, שמזוהים ע"י אותם תחלים, ע"י שימוש באנזים הגבלה SfcI , במתכונת RFLP-PCR . לאחר יישום המבחן לבדיקת בידודי שדה באזורים שונים, הסתבר שקימת שונות רבה יחסית ברצף הנוקליאוטידים באזור המטרה, ולא ניתן להבדיל בוודאות בין MA ו-MB רק על סמך שיטת RFLP (לויזון, לא פורסם; 10). כיוון שמקובל ש-MA נמצא רק בצאן ו-MB רק בבקר, אין בעיה של הגברת שני הפתוגנים במבחן PCR אחד, והמבחן נמצא בשימוש למטרת אבחון גם בשתי מעבדות באירופה (2).
- מבחן המבוסס על התחלים MAG-AURCL/R המזהים רצף נוקליאוטידים בגן ה- uvrC (17) . גם הגן uvrC נמצא בגנום של שני החיידקים MA ו- MB אבל ניתן לבחור רצף ייחודי לכל מין כבסיס למבחן מבדיל לשני החיידקים (מבחן MA-uvrC-PCR ו- MB-uvrC- PCR). לאחרונה דווח על התאמה של מבחן MB-uvrC-PCR לשימוש אבחוני (18).
- מבחן המבוסס על תחלים pol 1F/5R MAB- המזהים רצף נוקליאוטידים בגן DNA polymerase III (polC) (13). המערכת נבדקה במסגרת מחקר רחב הקף, שכלל 18 בידודי MA ו-56 בידודי MB מפונדקאים שונים (עז וכבש ל-MA, בקר ל-(MB, מארצות שונות באירופה ומאירועים נפרדים בעלי ביטוי קליני שונה (דלקת עטין, דלקת פרקים וללא סימנים ל-MA).
ב. יישום מבחני PCRבדוגמאות מבע"ח הידועות כנגועים ב- MA.
נתקלנו בבעיה של קבלת חומר קליני לבדיקת המערכות. ע"פ המידע המצוי בידנו לא היו אירועים של CA קליני בעדרים שמהם היה ניתן לקחת דגימות. חומר שדה שנבדק כלל שלושה עדרים:
I. עדר עזים עם היסטוריה של הדבקה חוזרת ב-MA. נבדקו דגימות חלב, דגימות מהאף, האוזן והפה.
II. נבדקו 6 דגימות חלב מעדר עזים עם היסטוריה של הדבקה חוזרת ב-MA. הדגימות היו מזוהמות בחיידקים אחרים ולא הצלחנו לבודד מיקופלסמה.
III. נבדקו 11 דגימות חלב מכבשים חולים קלינית ב-CA. לא הצלחנו לקבל דגימות של הפרשות אוזן ואף.
ג. בדיקת נשאות בבע"ח שמקורם בעדר שעבר אירוע של CA הנגרם ע"י MA.
על אף הבאת נכונות לכך לא קיבלנו חומר קליני מתאים לבדיקת נשאות.


שיטות:
1. תחלים למבחני :MA-PCR

2. תערובת ותוכניות הגברה למבחני PCR:
3.
ריאקציות ה-PCR בוצעו בתערובת מסחרית ABgene Reddy Mix PCR MasterMix (חב' תמר).
כל הריאקציות בוצעו ב- MJ Research PTC-200 thermocycler . תוצר ה-PCR הורץ בג'ל אגרוז 1.5% עם אטידיום ברומיד במכשיר אלקטרופורזה BioRad Mini-Sub DNA cell במתח של V 80-100, 30-40 דק'. צילום במצלמה דיגיטלית (Syngene GeneGenius). גודל התוצר נקבע ביחס לסמן מסחרי bp100 ladder DNA((BioRad.
• מבחן MA-PCR 16S rRNA בוצע בתנאים של Low stringency amplification לפי הספרות (11). גודל תוצר ההגברה הינו bp734. כדי לאשר שתוצר הריאקציה הינו MA ניתן לבצע חיתוך ע"י אנזים הגבלה SfcI . בריאקצית ההגבלה מתקבלים שני מקטעים של bp601 ו- bp 133 למרבית זני MA.
• מבחן uvrC-MA-PCR בוצע לפי Subramaniam et al (17). כדי לקבל הגברה של זני MA ווריאנטים שלא זוהו בתוכנית ההגברה הנזכרת לעיל, התוכנית שונתה ע"פ ההמלצה של Marenda et al (13). גודל תוצר ההגברה הינו .1624 bp
• מבחן MAB pol-PCR בוצע ע"פ Marenda et al (13) עם התחלים /5R MABPol-1F שהוזכר לעיל. גודל תוצר ההגברה הינו . 265 bp
4. הפקת DNA למבחן PCR: לצורך הפקת DNA מתרביות מיקופלסמה ודוגמאות קליניות השתמשנו בשיטת הרתחה boil)), המקובלת להפקת דנ"א באבחון מיקופלסמה. השיטה כוללת סירכוז של 1 מ"ל תרבית ב- 13000 RPM ל- 30 דק' ב- º C4, סילוק הנוזל העליון והרחפת המשקע בנפח של 0 µl5 O2H PCR. ה-DNA משוחרר ע"י הרתחה ב- C º105 ל-10 דק'. לאחר קירור מהיר ב- C º0 - 10 דק' בקרח הדוגמה מסורכזת פעם נוספת ב-13000 RPM ל- 5 דק' במטרה לסלק את חלקיקי התאים השבורים. הנוזל העליון המכיל את ה-DNA מועבר למבחנת אפנדורף נקייה ונשמר ב C º4 עד לבדיקה או ב- º20 -לאורך זמן.
הפקת דנ"א מדגימות חלב נעשתה בערכת DNA Isolation kit for blood / bone marrow / tissue Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)). הפקת דנ"א מתרבית של MA זן PG-2 נעשתה באותה ערכה. ריכוז הדנ"א נקבע בספקטרופוטומטר.
5. בידוד, זיהוי וגידול תרביות מיקופלסמה: בידוד וזיהוי מיקופלסמה בוצעו ע"פ הנהלים במעבדה הרפרנטית, שהם בהתאם לשיטות המומלצות הבינלאומיות ( 2 ). קרקע מזון לבידוד :MA +19 gm Heart Infusion Broth (DIFCO) 5 gm Yeast Extract (DIFCO) ב-850 מל H2O, pH 7.8 עם תוספת של 15% נסיוב סוס, Na Penicillin לריכוז סופי של 1000 U/מל ו- thallium acetate לריכוז סופי של .0.025% לצורך הכנת קרקע מזון מוצק הוסף12.5 gm Noble Agar (DIFCO). ניתן להוסיף 0.5% Na pyruvate ו- 0.005% phenol red לקרקע המזון הנזכר לעיל תוספת המאפשרת שינוי צבע המעיד על צמיחת MA ומשפרת את כייל החיידק בתרבית (4). זיהוי MA נעשה ע"י הגבת מושבות מיקופלסמה עם נוגדנים ספציפיים בשיטת אימונופלורסנציה ((IMF.
6. סגוליות מבחני PCR נבדקה עם זני MA שבודדו בארץ בשנים 2003-2005, כדלקמן:,מס' 951, כפר מקר (חלב עז); מס' 869 , בן עמי (דלקת פרקים, עז); מס' 11 , בית זייד (חלב, כבשה); מס' 894 , נוב (חלב, עז); מס' 40, שדה יעקוב (חלב, עז); ,מס' 628, באר יעקוב (דלקת ריאות, עז).
7. לקיחת דגימות מבע"ח: שיטת דיגום חלב ע"פ הכללים לבדיקה בקטריולוגית. דיגום הפרשות אוזניים לפי המלצות של Gil et al (6,8). בדיקת MA-ELISA נעשתה בערכה מסחרית ,ELISA Aga- Institut Pourquier Montpellier France) ), ), ע"פ הוראות היצרן.


תוצאות ודיון:
במחקר התמקדנו בבחינת היכולת לשלב את טכניקת ה-PCR במערך אבחון וניטור MA במשק הצאן בארץ. הדגש היה על יישום עתידי של שיטות MA-PCR בבדיקות של חומר קליני. כל שלושת מבחני ה- PCR שבחרנו לבחון במחקר זה פותחו במעבדות באירופה. אימות כל שלושת המבחנים נעשה בעיקר לגבי זני MA שבודדו באירופה ועל כן חסר מידע לגבי יכולתם לזהות זני MA מהמזרח התיכון, לרבות ישראל. לכן, כמפורט בהמשך, ראינו חשיבות בבדיקת סוגיה זו. יתר על כן, עד כה השימוש העיקרי במבחני MA-PCR היה למטרת זיהוי בידודי MA מתרביות ואין מספיק מידע על יישומם בבדיקת חומר קליני (2,6) .


1. רגישות אנליטי של מבחני PCR:
מבחן ה- Mag-MA-PCRמזהה רצף נוקליאוטידים בגן 16S rRNA של חיידק ה- MA או MB (11). השיטה יושמה במעבדתנו כגיבוי לשיטות קלאסיות של זיהוי בידודי שדה שמתקבלים לאפיון, אם כי עד כה השתמשנו בתחלים עם זיקה מועדפת ל-MB. במחקר זה השתמשנו בתחלים Mag F/R בעלי זיקה מוגברת ל-MA. תנאי הגברה מוגבלים (high stringency)עם תחלים אלה מאפשרים הגברה מעודפת של MA בסדר גודל של פי ארבעה עשירונים לעומת הגברת MB, אבל בתוכנית הגברה זו רגישות השיטה ל- MB הייתה נמוכה בערך פי 100 מהרגישות של אותם התחלים ב- low stringency data not shown)). לצורך בדיקת רגישות השוואתית השתמשנו בתנאי הגברה low stringency, כמפורט בפרק שיטות. ניתן להבדיל בין תוצר PCR של MA וזה של MB במבחן RFLP-Mag-MA-PCR, ע"י שימוש באנזים הגבלה SfcI . בתרשים מס' 1 מוצגת תבנית הגבלה של זני יחוס ובידודי שדה MA ו-MB. בערוץ המסומן uncut נמצא תוצר Mag-MA-PCR ללא הגבלה וסמוך אליו סמן מולקולארי. תוצאות הגבלה לזן יחוס PG-2 MA ו-4 בידודי שדה של MA נמצאים בערוצים מס' 1, 2, 4, 5 ו-6 בהתאמה. תבנית ההגבלה ל-MA מראה 2 מקטעים בגודל 601 bp ו- 133 bp, כצפוי. בערוץ מס' 3 נמצא תוצר RFLP- Mag-MA-PCR של זן יחוס MB PG-45 הנותן תבנית הגבלה בעלת 4 מקטעים178 , 423, 601) ו- (133 bp. ההבדל ב-RFLP בין MA ו- MB נובע מהימצאות של שני גנים המקודדים ל-16S rRNA, כאשר ב-MB, ולא ב-MA, קיימת שונות באתר ההגבלה לאנזים SfcI באחד הגנים. כתוצאה מכך, בהגבלה של תוצר ה-PCR של MB זן הייחוס מראה תבנית הגבלה של שני הגנים. בערוץ מס' 7 נמצא בידוד ישראלי של MB הנותן תבנית הגבלה שאינה מתאימה לזני הייחוס. המצאות של מספר לא מבוטל של בידודים המראים תבנית הגבלה שונה מזן הייחוס מהווה בעיה בשימוש במבחן זה ככלי עזר בהגדרת המין. דווח בספרות על בידודי atypical MA, בעלי שונות בתבנית RFLP, אבל הם טרם אופיינו בארץ. כאן המקום לציין שבניגוד לעיקרון של absolute host specificity לפיו הדבקה של MA מוגבלת לצאן (small ruminants) וחיידק MB נמצא רק במעלי-גירה גדולים ,הסתבר לאחרונה בעזרת אפיון מולקולארי שניתן לבודד MA גם מבקר (13).
מבחן ה- uvrC-MA-PCR מבוסס על גן אשר מכלל מיני המיקופלסמות הוא ייחודי ל-MA ו-MB בלבד. מבין כל מיני המיקופלסמות. נבחרו תחלים ייחודיים ל-MA (MAG-AURCL/R) שאינם מזהים MB. בבדיקות סגוליות שנעשו באירופה המבחן זיהה בדייקנות 25 בידודי MA, כולל כמה זנים שלא זוהו ע"י מבחן ה- RFLP- Mag-MA-PCR (2 ). אף על פי כן, במחקר נוסף נמצא שבתנאי הריאקציה המקוריים לא זוהו מספר זני MA שבודדו בצרפת וספרד (13) והומלץ על שינוי הפרוטוקול אותו אמצנו במחקרנו.
מבחן נוסף שפותח בשנה האחרונה הוא pol PCR MAB- המבוסס על גן המקודד לחלבון polymerase C ב- MA ו- MB. סגוליות של התחלים הייחודיים שנבחרו לזהות את MA 1F/5R) MABPol נבדקה עם כל 7 מיני המיקופלסמה החשובים בצאן ובקר, ובידודי השדה של MA ו-MB שנאספו במסגרת סקר שנערך באיחוד האירופי אשר נחשבו "בעיתיים" מבחינת אפיון. האוסף כלל בידודים נבחרים מצפון אפריקה והודו, אבל אין בו בידודים מישראל או ממדינות השכנות לה.
בשלב הראשון נבדקה הרגישות האנליטית (analytical sensitivity) של שלושת המבחנים. הניסוי נעשה עם דנ"א מנוקה שהופק מזן יחוס MA-PG2 . השוונו את הרגישות בשני תנאי ריאקציה (תערובת עם Taq polymerase ABgene או REDDYMIX ABgene) ומצאנו שיש התאמה למרבית מערכות ה- PCR שבשימוש ביחידתנו.
התוצאות של השוואה רגישות אנליטית מוצגות בתרשים מס' 2. בכל פנל כמות הדנ"א שנבדקה הייתה 11.4 pg, 114 pg, 1.14 ng, 11.4 ng 11.4 fg, 114 fg, 1.14 pg, בערוצים מס' 1 עד 6 בהתאמה. ביקורת ללא דנ"א מופיעה בערוץ מס' 7. בתרשים מס' 2, פנל A-I ,B-I ו-C מוצגות תוצאות של ריאקציה עם תערובת PCR בהכנה עצמית ובפנל A-IIו- B-II תוצאות הריאקציה תוך שימוש בתערובת REDDYMIX . ניתן לראות שמבחן Mag-MA-PCR מזהה 1.14 pg דנ"א (פנל A-I ו-A-II ,ערוץ מס'5 ) בשני סוגי התערובת שנבדקו. בפנל B מוצגות תוצאות בדיקת הרגישות של מבחןMAB-pol-PCR . בתערובת REDDYMIX )פנל (B-IIרגישות המבחן הייתה .1.14 pg אמנם בתערובת ההכנת עצמית הריאקציה הייתה פחות רגישה וכמות הדנ"א המזוהה הייתה 11.4 pg (פנל B-I, ערוץ מס' 4). בפנל C מוצגות תוצאות של מבחן uvrC-MA-PCR, שלא הצליח בתערובת REDDYMIX ורק 114 pg דנ"א זוהה בתערובת השנייה. יש להניח שניתן לשפר את תוצאות הרגישות למבחן הזה ע"י אופטימציה של תנאי הריאקציה בהתאם לספרות (13), אבל גודל התוצר ((1624 bp צפוי להוות מגבלה גם בתנאים המשופרים. ע"פ תחשיב של גודל הגנום של MA רגישות של 1.14 pg דנ"א גינומי משתווה לזיהוי של כ-103 תאי MA בריאקצית ה-PCR או כ-103 X 5 תאי MA למ"ל של החומר הנבדק.
מסקנה: שני המבחנים מראים אותה רגישות אנליטית לגבי דנ"א של זן יחוס של MA. ניתן להשתמש בתערובת REDDYMIX, בכך להקל על תהליך הביצוע.


2. סגוליות המבחנים: תוצאות הסגוליות של מבחני Mag-MA-PCR ו- MAB-pol-PCR כנגד כל המינים הרלבנטיים של מיקופלסמה שנמצאים בצאן ובקר פורסמו ( 11,16,18), ולא חזרנו על בדיקות אלו. אך סגוליות של שני המבחנים נבדקה לגבי זני MA שבודדו בארץ. נבדקו זן יחוס MA-PG-2 ו-6 בידודי MAמאירועים שונים מבחינת מקום, פונדקאי (עז או כבשה) ומופע קליני. הפקת דנ"א מתרביות הייתה בשיטת "”boil (לא מנוקה). התוצאות מוצגות בתרשים מס' 3. נבדקו שלושה ריכוזי דנ"א (ללא מהול, 10-2 ו- 10-4) שמופיעים בערוצים צמודים לכול בידוד (קב' 1,;MA-11 קב' 2 , ;MA-40קב' 3 ,;MA-628 קב' 4,;MA-869 קב' 5, ;MA-894 קב' 6, MA-951). בפנל A מוצגות תוצאות עם מבחן Mag-MA-PCR, שמצליח לזהות את כל זני ה-MA בכל ריכוז שנבדק. כיון שהגן שמקודד ל-16S rRNA שמור מאד (highly conserved) בין זנים התוצאה הייתה צפויה. להבדיל, מבחן MAB-pol-PCR לא מזהה את כל הזנים באותה יעילות (פנל B). למשל, דנ"א מבידוד 628 (מסומן כקב' 3) זוהה רק בריכוז הגבוה . מעניין לציין שזן זה בודד מדלקת ריאות בעז מבוגר (3 שנים), מופע קליני נדיר ל-MA. יש צורך להרחיב את הממצאים הראשוניים ע"י בדיקת מספר רב יותר של בידודים וקביעת רצף הנוקליאוטידים של תוצר ה-PCR והשוואה בין הזנים. למרות זאת, גם בשלב זה, התוצאה מצביעה על הצורך לבחון את ההתאמה של המבחנים לזני MA המקומיים.
מסקנה: קיימת אפשרות ששונות גנטית בגן המטרה בין בידודי MA מקומיים לבין הזנים השכיחים באירופה דורשת התאמה של בדיקות מולקולאריות, כגון מבחן MAB-pol-PCR.


3. בדיקת רגישות אבחונית (diagnostic sensitivity) נעשתה ע"י הוספת כמויות שונות וידועות של דנ"א לדגימות חלב (spiked samples) והפקת דנ"א בערכת QIAGEN. התוצאות של הבדיקות בשני מבחני PCR מוצגות בתרשים מס' 4. ריכוזי הדנ"א חושבו לכל ריאקציה, ונעו בין 403 ng(ערוץ מס' 1) ו- 5.6 pg (ערוץ מס' 9). הכמות המינימאלית של דנ"א שזוהתה ע"י מבחן Mag-MA-PCR הייתה 140 pg (פנל A) ו-2 ng ע"י מבחן MAB-pol-PCR. בהשוואה לרגישות האנליטית של המבחנים, שהיא כ- ,1.14 pg ההבדל ברגישות אנליטית ורגישות אבחונית הינו כ- 103. התוצאות שתתקבלו הן בהתאם לספרות לגבי שימוש ב- MB-PCR לאבחון נוכחות בחלב פרות, אבחון המתאפשר רק לאחר העשרה בתרבית או בעזרת שיטות של nested PCR . ההבדל בין התוצאות של שני המבחנים אינו מובן.
מסקנה: הרגישות האבחונית של שני מבחני MA-PCR שנבדקו מאפשרת זיהוי של MA בדגימות חלב בהן כמות חיידקי ה-MA גבוהה מאוד (106 חיידקי MA ויותר למ"ל חלב), כפי שקורה במצב של מחלה אקוטית. השיטה לא מתאימה למעקב נוכחות MA בחולבות לאחר התקופה האקוטית או לבדיקת אצוות חלב במיכל.


4. בדיקת דגימות מבע"ח נגועים:
התקבלו דגימות מ-8 עזים חולבות מעדר שעבר אירוע קשה וממושך של CA. החיות היו בהסגר ואיכות החלב לא הייתה טובה. מתוך 8 חיות, 6 היו חיוביות במבחן ELISA-MA ע"פ התוצאות של מעבדת אבחון צפון. בניסיון בידוד רק דגימת חלב אחת הייתה חיובית ל-MA. יש להניח שהנוכחות של מספר רב של חיידקים מזהמים בחלב הפריעה לבידוד של MA שהיה, אם בכלל, ברמה נמוכה בחלב. כמו כן, נבדקו דגימות של הפרשות אוזניים, משטחי אף ומשטחי פה מאותם בע"ח, שהוזכרו בספרות כמאגרים אפשריים של מיקופלסמה (5,6,8). ממרבית הדגימות בודדו מינים שונים של מיקופלסמה, הן מיני מיקופלסמה ספרופיטים מוכרים והן מינים שלא ניתנים לזהות. לא בודד MA מהפרשות אוזן או אף גם לא במקרה של העז שהפרישה את החיידק בחלב. הדגימות נשמרו להמשך בדיקה מולקולארית אבל בעקבות תוצאות הבידוד ראינו שהחומר לא התאימה לצרכי הניסויים שלנו.
- התקבלו דגימות מ-6 עזים חולבות מאותו העדר. החיות היו בהסגר ואיכות החלב לא הייתה תקינה. כל הדגימות היו מזוהמות ע"י חיידקים מסוגים שונים, חלקם כתוצאה מזיהום סביבתי. לא בודדה מיקופלסמה.
- התקבלו דגימות מ-11 כבשים חולבות חולות במחלת CA אקוטית. בודד MA מכל דגימה. בנוסף לזיהוי התרביות בשיטה המקובלת ע"י אימונופלורסנציה ישירה ובלתי ישירה בדקנו את היכולת להשתמש בשיטות MA-PCR לזיהוי מהיר של הבידוד. נבדקו דגימות דנ"א שהופקו בשיטת ההרתחה מתרביות MA בשני המבחנים. מבחן MAB-pol-PCR זיהה את MA בכל דגימה בעוד שמבחן Mag-MA-PCRזיהה רק 6/11 של התרביות החיוביות. בבדיקה נוספת של אותן דגימות נמצא שניתן לזהות MA בדוגמאות ה"שליליות" לאחר מיהול של הדוגמה, 10-2)ו- 10-4) , ממצא המעלה את האפשרות של נוכחות מעכבים של ריאקצית ה-(1) PCR. במקרה זה, הפקת דנ"א באמצעות ערכת הפקה אמור לשפר את התוצאות.
מסקנה: שימוש ב- MA-PCR יכול לקצר את הזמן הדרוש לזיהוי בידודי מיקופלסמה.


סיכום:
במחקר זה נבחנה האפשרות של שילוב מבחני MA-PCR במערך ניטור MA בעדרי צאן. נערכה השוואה בין שיטות PCR מבחינת רגישות וסגוליות. ניתן לזהות MA בדנ"א שהופק מדגימות לאבחון כאשר מספר חיידקי MA בחומר הנבדק הוא לפחות 103 תאים. הרגישות האבחונית של שניים מתוך שלושה מבחני MA-PCR שנבדקו (במבחן RFLP- Mag-MA-PCR ו- pol PCR (MAB- מאפשרת זיהוי של MA בדגימות חלב בהן כמות חיידקי ה-MA גבוהה מאוד (106 חיידקי MA ויותר למ"ל חלב), מצב הקיים בזמן מחלה אקוטית. השיטה לא מתאימה למעקב אחר נוכחות MA בחולבות לאחר השלב האקוטי או בדיקת אצוות חלב במיכל. שימוש של טכניקת PCR לצורך זיהוי תרביות מיקופלסמה מומלץ כדי לקצר את הזמן עד קבלת האבחון המדויק. יישום השיטה למטרת ניטור בבע"ח ללא סימני מחלה לא נבחן כנדרש בגלל מחוסור בחומר קליני מתאים.


שטח הפעלה של כל משתתף:
דר' ש. לויזון, אחראית על מעבדת המיקופלסמה, המכון הווטרינרי. מרכזת המחקר. אחראית על אבחון מיקופלסמה בדוגמאות קליניות, בדיקת תקיפות של שיטות האבחון
דר' א. ליסנינסקי, חוקרת ביחידת המיקופלסמה הממונה על יישום ופיתוח של השיטות המולקולאריות
ש. זמיר, רופא ראשי למחלות צאן, אחראי על קבלת חומר קליני לבדיקה. הוא אחראי על איתור עדרים נגועים ב-MA ותאום בין מערכתי של תוכניות ניטור וביעור MA.


רשימת ספרות:

1. Apfalter, P., Reischl, U. & Hammerschlag, M. R. (2005). In-House Nucleic Acid Amplification Assays in Research: How Much Quality Control Is Needed before One Can Rely upon the Results? J. Clin. Microbiol: 43, 5835-5841.


2. Bashiruddin, J. B., Frey, J., Konigsson, M. H., Johansson, K. E., Hotzel, H., Diller, R., de Santis, P., Botelho, A., Ayling, R. D., Nicholas, R. A., Thiaucourt, F. & Sachse, K. (2005). Evaluation of PCR systems for the identification and differentiation of Mycoplasma agalactiae and Mycoplasma bovis: A collaborative trial. Vet J 169, 268-275.


3. Bergonier, D., X. Bertelot and F. Poumarat (1997). Contagious Agalactia of small ruminants: current knowledge concerning epidemiology, diagnosis and control. Rev.sci.tech.Off. int.Epiz. 16(3): 848-873.


4. Chopra-Dewasthaly, R., Zimmermann, M., Rosengarten, R. & Citti, C. (2005). First steps towards the genetic manipulation of Mycoplasma agalactiae and Mycoplasma bovis using the transposon Tn4001mod. Int J Med Microbiol 294, 447-453.


5. DaMassa, A.J., J.G. Tully, D. L. Rose, D. Pitcher, R. H. Leach, and G. S. Cottew. (1994). Mycoplasma auris sp. nov., Mycoplasma cottewii sp. nov.,, and Mycoplasma yeatsii sp. nov., new sterol-requiring mollicutes from the external ear canals of goats. Int. J. System. Bact.44: 479-484.


6. De la Fe, C., Assuncao, P., Antunes, T., Rosales, R. S. & Poveda, J. B. (2004). Microbiological survey for Mycoplasma spp. in a contagious agalactia endemic area. Vet J 170, 257-259.


7. De la Fe, C., Assuncao, P., Rosales, R. S., Antunes, T. & Poveda, J. B. (2006). Characterisation of protein and antigen variability among Mycoplasma mycoides subsp. mycoides (LC) and Mycoplasma agalactiae field strains by SDS-PAGE and immunoblotting. Vet J 171, 532-538.


8. Gil, M.C., M. Hermoso de Mendoza, J. Rey, J.M. Alonso, J. B. Poveda and J. Hermoso de Mendoza (1999). Isolation of mycoplasmas from the external ear canal of goats affected with Contagious Agalactia. The Veterinary Journal: 158:152-154.


9. Greco, G., Corrente, M., Martella, V., Pratelli, A. & Buonavoglia, D. (2001). A multiplex-PCR for the diagnosis of contagious agalactia of sheep and goats. Mol Cell Probes 15, 21-25.


10. Heldtander-Konigsson, M., G. Bolske, and K-E Johansson. (2002). Intraspecific variation in the 16S rRNA gene sequences of Mycoplasma agalactiae and Mycoplasma bovis strains. Vet Microbiol. 85: 209-220.


11. Johansson, K-E., L. Berg, G. Bolske, S. Deniz, J. Mattsson, M. Persson and B. Pettersson. (1996). Specific PCR systems based on the 16S rRNA genes of Mycoplasma agalactiae and Mycoplasma bovis. . In: Mycoplasma of Ruminants: pathogenicity, diagnostics, epidemiology and molecular genetics (COST 826).Eds: J. Frey & K. Sarris. Brussels, European Commission Press.I:88-90.


12. Levisohn, S., R. Flitman-Tene, E. Rapapport and D. Yogev (2001). Genomic fingerprinting of Mycoplasma agalactiae in chronically infected sheep. In: Mycoplasma of Ruminants: pathogenicity, diagnostics, epidemiology and molecular genetics (COST 826). Eds: J. Poveda, A. Fernandez, J. Frey and K. E. Johansson. Brussels, European Commission Press. V: 42-45.


13. Marenda, M. S., Sagne, E., Poumarat, F. & Citti, C. (2005). Suppression subtractive hybridization as a basis to assess Mycoplasma agalactiae and Mycoplasma bovis genomic diversity and species-specific sequences. Microbiology 151, 475-489.


14. Pepin, M.,Dufour, P. ,Lambert, M., Aubert, M., Valognes, A., Rotis, T., Van de Wiele, A. and D. Bergonier, (2003). Comparison of three enzyme-linked immunosorbent assays for serologic diagnosis of Contagious Agalactia in sheep. J. Vet. Diagn. Invest.15: 281-285.


15. Rapoport, E., R. Flitman-Tene, D. Yogev and S. Levisohn (1999). Outbreaks of Contagious Agalactiae in Israel: Clinical and epizootical aspects. In: Mycoplasma of Ruminants: pathogenicity, diagnostics, epidemiology and molecular genetics (COST 826).Eds: L. Stipkovits, R. Rosengarten and J. Frey. Brussels, European Commission Press. III: 120-123.


16. Riberio, V.R., E. R. do Nascimento, J.L.H. Faccini, M. F. do Nascimento and G. B. Lignon (1997). An improved method for the recovery of mycoplasmas from the external ear canal of goats. J. Vet. Diagn. Invest. 9: 156-158.


17. Subramaniam, S., D. Bergonier, F. Poumarat, S. Capaul, Y. Schlatter, J. Nicolet and J. Frey (1998). Species identification of Mycoplasma bovis and Mycoplasma agalactiae based on the uvrC genes by PCR. Mol. Cell. Probes 12: 161-9.


18. Thomas, A., I. Dizier, A. Linden, A., J. Mainil, J. Frey and E.M. Vilei. (2004). Conservation of the uvrC gene sequence in Mycoplasma bovis and its use in routine PCR diagnosis. Vet. J: 168: 100-102.

 

 

 

 

לכל המבזקים....
office@milk.org.il פקס: 972-3-9564766 טל: 972-3-9564750 דרך החורש 4 (בניין אפריקה ישראל), יהוד 5647003
מופעל באמצעות מעוף - מגוון אפקט