תוכנית מחקר מספר 362-0121-07

 

הזרעה מלאכותית בכבשים עם זירמה קפואה

 

דוח סופי לשנים 2007

חיים גסיטוע, יוסף סרגוסטי, אלכסנדר רוזוב, אמיר ערב
מנהל המחקר החקלאי, מכון לחקר בעלי חיים

 

מבוא ותיאור הבעיה
להקפאת זרמת אילים חשיבות רבה במקרים בהם מתכננים הזרעות מחוץ לעונת הרבייה, קיום בנק זרע עתידי או להעברת חומר גנטי משובח. בניגוד לזרמת בקר, הקפאת זרמת אילים, הייתה מאז ומתמיד אתגר למחקר הקריוביולוגי בשל העובדה שתאי זרע של אילים רגישים במיוחד לקירור והקפאה.
הגורמים העיקרים המשפיעים על ההישרדות תאי זרע במהלך תהליך הקפאה וההפשרה שלאחריה הם: סוג החומר המשמר, ריכוז תאי הזרע, דרגת העמידות של תאי הזרע לעקת הקור, וקצבי הקפאה והפשרה.
בניסוים בשנים קודמות עדיין לא התגברנו על אחוזי התעברות נמוכים של הכבשים לאחר הזרעה עם זרמה קפואה, וזאת למרות שהשתמשנו בתמיסות שבמבחני הערכת איכות זרמה מעבדתיים נתנו תוצאות מתקבלות על הדעת. לאחרונה בדקנו את ההתאמה של תמיסת Andromed (Minitub, גרמניה) ושל תמיסת ניו זילנד להקפאה בנפחים גדולים. תמיסת Andromed מכילה שומנים ממקור צמחי ונמצאת היום בשימוש במכוני הזרעה של פרים. יתרונה שאינה מכילה חומרים מן החי ולכן היא בעלת בטיחות ביולוגית גבוהה. היא נמצאה על ידנו מתאימה להקפאת זרמה של עזים עם תוצאות טובות בניסוי שדה (Gacitua and Arav, 2005). תמיסת ניו זילנד פותחה לשימוש בהזרעות מלאכותיות בכבשים.
מאז שנות ה- 50 נחקרה הקפאת הזרמה בבעלי החיים השונים, לאחר הצלחת הקפאה זרמה של פרים (Polge., 1949). הקפאת זרמה הביאה להתקדמות גנטית עצומה בענף הבקר. לצערנו זרמת בקר היא כמעט היחידה היום הניתנת להקפאה בהצלחה יחסית גבוהה, עם בין 50% ל- 70% חיוניות לאחר ההפשרה ואחוזי הצלחה גבוהים בהזרעה טרנס-צרווקלית. אולם בכבשים המצב שונה. חיוניות הזרמה נפגעת בזמן ההקפאה ובין 40% ל-50% מתאי הזרע מתים (Watson, 2000). בנוסף, ברוב הכבשים צוואר הרחם סגור בזמן ההזרעה וההזרעה מתאפשרת רק בפתח צוואר הרחם (צרויקלית). רק אחוז מאוד קטן ניתן להזריע לתוך הרחם כמו בבקר. בעקבות שיפור טכניקות ההקפאה וההפשרה, בשילוב עם חומרי שמור זרמה מודרניים כפי שנעשה בעזים (Gacitua and Arav, 2005, גסיטוע וחובריו, 2004), נצפה שיעלו אחוזי חיוניות הזרע לאחר ההקפאה וכתוצאה מכך יעלו גם אחוזי ההתעברות. הצלחה בתחום שימור הזרע בהקפאה עמוקה תוביל לשימוש נרחב של הזרעות מלאכותיות עם זרמה שהוקפאה וזאת באמצעות הקמת בנק זרע עתידי ובעקבות כך להתקדמות גנטית משמעותית.


מטרת המחקר
לכמת את ביצועי הרבייה של רחלות המוזרעות בזרמה קפואה, על בסיס תמיסת מיהול Andromed או תמיסת ניו זילנד ולהשוות אותם לאלו של רחלות המוזרעות בזרמה טרייה. תוכנית העבודה כוללת שתי קבוצות ניסוי: א. ביקורת - הרחלות יוזרעו עם זרמה טרייה שנמהלה לאותו ריכוז כמו של הזרמה הקפואה . ב. ניסוי - הרחלות תוזרענה בזרמת אילים שהוקפאה בשיטת ההקפאה הכיוונית בנפחים גדולים. מנת ההזרעה תכלול כ- 106 ×225 תאי זרע בנפח של 0.25 סמ"ק. כל כבשה תוזרע בשני מועדים במרווח זמן של 7-8 שעות ביניהם. הזרעה הראשונה תתבצע 50 שעות לאחר הוצאת ספוגיות הפרוגסטרון ומתן PMSG.
לפי כך, בשנה הראשונה ביצענו ניסויים מקדימים לאיתור פרוטוקול ההקפאה המיטבי וזאת באמצעות בחינה מעבדתית של הזרמה לאחר הקפאה והפשרה, שתכלול בדיקה מקרוסקופית לתנועתיות, צביעה פלורוצנטית לבדיקת מידת הפגיעה בממברנות הציטופלסמטיות ומידת הפגיעה באקרוסום. כמו כן נבדוק מה הוא ריכוז תאי הזרע המיטבי להקפאה בנפחים גדולים ואיזו תמיסת הקפאה נותנת תוצאות טובות יותר.


שיטות ניסיוניות
עיקרי ביצוע הניסוי: זירמה של אילים מגזע אסף או אפק בני 3-4 שנים הופקה בחודשי עונת הרבייה ועורבבה (Pooled) כדי לצמצם את השפעת האיל הבודד. הזרמה נמהלה בתמיסת ההקפאה לריכוז הרצוי, קוררה והוקפאה במבחנות של 8 סמ"ק בשיטת הקפאה כוונית לפי Gacitua and Arav, 2005. בשיטה זו המבחנות מוסעות דרך מפל טמפרטורה מ- Cº5 ל-C º50- במהירות הקפאה קבועה של 1.0 מ"מ לשניה, דבר המאפשר קצב הקפאה ומבנה גבישי קרח מבוקרים. לאחר לקיחת הזירמה נבדקו הנפח והחיוניות במיקרוסקופ ונקבע ריכוז הזרע ובהתאם לכך נבחרו מספר אילים עם תכונות זרמה טובות. הזרע נמהל לריכוז הרצוי והזרמה המהולה קוררה בהדרגה ל- Cº5 במשך 2.5-3 שעות ואז הוקפאה. הזירמה נשמרה בחנקן נוזלי, בטמפרטורה של Cº196-, עד להפשרתה וביצוע הבדיקות המעבדתיות.
הניסויים היו במבנה של 2 × 3:
הזרמה נמהלה לשלושה ריכוזים שונים - 700, 800, 900 מיליון תאי זרע לסמ"ק למציאת הריכוז המקסימאלי המיטבי.
הזרמה נמהלה בשתי תמיסות מיהול Andromed, New Zealand למציאת תמיסת המהול המיטבית.
בסוף הניסוי יקבע פרוטוקול הקפאה להמשך העבודה


טבלה מס' 1.
ניסוי הקפאת זרמה באילים, בחינת שתי תמיסות מהול ושלוש ריכוזים

טבלה 1: H33342 - צביעה פלורוצנטית שצובעת את כל התאים. FITC - צביעה פלורוצנטית שצובעת תאי זרע עם אקרוזום פגוע, PI - Propidium Iodide - צביעה פלורוצנטית שצובעת תאים עם ממבראנה ציטופלסמטית פגועה. אותיות שונות באותה עמודה מראות על הבדל מובהק עם P<0.05.


תוצאות ודיון:
לא נמצאו הבדלים מובהקים בין שתי התמיסות בתנועתיות אחרי מהול זרמה הטרייה בזמן אפס (תוצאות לא מפורטות) אך נמצאו הבדלים מובהקים בתנועתיות אחרי הפשרה בין שתי התמיסות. בעוד שתמיסת Andromed נתנה בריכוזים של 700, 800 ו- 900 מיליון תאי זרע לסמ"ק 36.6%, 37.8% ו- 36.1% בהתאמה, תאי זרע שהוקפאו עם תמיסת ניו זילנד בריכוזים של 800 ו- 900 מיליון תאי זרע לסמ"ק נתנו תוצאות טובות יותר עם תנועתיות של 43.3% ו- 54.1% בהתאמה. לא נמצאו הבדלים בין שתי התמיסות ובריכוזים השונים כאשר נבדקה שלמות האקרוזום. הבדלים מובהקים נמצאו בשלמות ממברנות התא (viability) בין שתי התמיסות. בעוד שעם תמיסת ניו זילנד 38.9% ו-32.8% מהתאים שמרו על חיוניותם בריכוזים של 800 ו- 900 מיליון תאים לסמ"ק, עם תמיסת Andromed רק 10.6%, 14.7% ו- 14.7% מתאי הזרע שמרו על חיוניותם לאחר הפשרה כאשר הוקפאו בריכוזים של 700, 800 ו- 900 מיליון תאים לסמ"ק, בהתאמה.
לאור התוצאות ברור כי תמיסת ניו זילנד מגנה טוב יותר על ממברנות תאי זרע בזמן הקפאה. כאשר נבחנו שני הריכוזים בהם הוקפאו תאי הזרע עם תמיסת ניו זילנד נראה כי ריכוז של 900 מיליון תאי זרע לסמ"ק נותן תוצאות טובות יותר, אם כי לא מובהקות סטטיסטית. שלמות ממבראנת האקרוזום בריכוז של 900 מיליון תאים לסמ"ק נמצאה ב- 62.5% מהתאים לעומת 59.4% בריכוז של 800 מיליון תאים לסמ"ק, והבדל דומה נמצא גם בתנועתיות התאים לאחר הפשרה שהייתה 54.1% ו- 43.3% בריכוזים של 900 מיליון ו- 800 מיליון תאי זרע לסמ"ק בהתאמה.
בהסתמך על תוצאות אלה הוחלט בהמשך הניסוי להקפיא זרמה עם תמיסת ניו זילנד בריכוז הגבוהה של 900 מיליון תאים לסמ"ק לקראת ההזרעות שנעשו בשנה הנוכחית. כמו כן הוחלט להוסיף קבוצה של הרבעה טבעית כפי שנעשה במשק כקבוצת ביקורת.


תוצאות ניסוי הזרעות 2007
בניסוי ההזרעות השתתפו 264 כבשים מתוכן 107 טליות בנות 8-9 חודשים ו-157 חולבות בנות 2-5 שנים. מספר הכבשים בקבוצת הניסוי (זירמה קפואה) היה דומה למספרן בקבוצת הביקורת (זירמה טרייה). שתי הקבוצות הוזרעו במנות זירמה עם ריכוז תאי זרע של 900 מיליון תאים לסמ"ק. ההזרעות כללו שתי הזרעות צרוויקליות, הראשונה 50 שעות לאחר הוצאת הספוגיות והשנייה ו- 7-8 שעות מאוחר יותר. כל כבשה קבלה שתי מנות הזרעה בנפח של 0.25 מ"ל וכמות תאים כוללת של 225 מליון תאי זרע בכל אחת. מתוך 157 החולבות, 58 כבשים שימשו כבקורת של המשק והורבעו בהרבעה מבוקרת. כל כבשה קבלה הרבעה אחת ולאחר מכן הוכנסו זכרים לתוך הקבוצה. חלוקת הקבוצות מפורטת בטבלה מס' 2.


טבלה מס' 2
ניסוי הזרעות קבוצת ניסוי (זירמה קפואה) ובקורת (זירמה טרייה והרבעה טבעית)

תוצאות בדיון
נמצאו הבדלים מובהקים (P<0.01) בתוצאות אחוזי ההתעברות בין הזרעה עם זירמה טרייה להזרעה עם זירמה קפואה באותו ריכוז תאי זרע (900 מילין לסמ"ק) הן בין הטליות והן בין החולבות. אחוז ההריונות בטליות היה 21% לזירמה טרייה ו-2% לזירמה קפואה, ובחולבות - 18% לזירמה טרייה ו-2% לזירמה קפואה. לא נמצאו הבדלים מובהקים בין החולבות שהוזרעו בזרמה טרייה לטליות שהוזרעו בזרמה טרייה או בין החולבות לטליות שהוזרעו בזרמה קפואה. הבדלים מובהקים (P<0.001) נמצאו גם בין אחוזי התעברות בכבשים שהורבעו הרבעה טבעית מבוקרת (83% התעברו) לבין יתר הקבוצות. בעבר דווח כי פוריות הכבשים מאוד נמוכה בעקבות הזרעה עם זירמה קפואה-מופשרת (Salomon and Maxwel, 1995b). בין הגורמים הבולטים לפוריות הנמוכה נמנים האנטומיה של צוואר הרחם וחוסר היכולת של הזירמה הקפואה-מופשרת לעבור את המחסום הזה (Eppleston and Maxwell, 1993). למספר תאי הזרע להזרעה חשיבות רבה לכן הזרענו עם ריכוזים גבוהים כדי לפצות על תאי הזרע שנפגעו בתהליך הקפאה. לפי (Evans and 1987,Maxwell), מספר התאים המינימאלי להבטיח פוריות טובה בהזרעות צרוויקליות הוא 100 מיליון לזירמה טרייה ו-180 מיליון לזירמה קפואה. בניסוי שלנו השתמשנו בכמות של 225 מיליון תאי זרע למנת ההזרעה פעמיים ביום, למרות זאת תוצאות הפוריות עם זירמה טרייה היו נמוכות בהשוואה לביקורת (הרבעות טביעות) מה שאומר כמות תאי הזרע שניתנו בהזרעות לא הספיקה כדי לפצות על ההבדלים בין הרבעה טבעית להזרעה מלאכותית. כמובן, בזירמה הקפואה שנפגעה בתהליך ההקפאה נגרם נזק בלתי הפיך לממברנות התאים והאקרוזום, נזק שהרג כ- 50% מהם כפי שרואים בטבלה מספר 1.
לסיכום ולאור התוצאות לא הצלחנו להגיע לתוצאות פוריות מספיק טובות בשיטת הקפאה כוונית, תמיסה ובריכוזי הזירמה שהשתמשנו, בגזע אסף לחלב ובתנאי הארץ. בהמשך יהיה עלינו לבחון שיטה מתאימה יותר להקפאת זרמת אילים, תמיסות חדשות שנותנות הגנה טובה יותר לזירמה בזמן הקפאה וכמוכן לעלות במספר תאי זרע למנת הזרעה. כמו כן נחוץ למצוא דרכים חדשים לשיפור הזרעות טרנסצרויקליות על מנת להעלות את אחוזי ההתעברות גם ללא קשר להקפאת התאים.


ספרות
1. ח. גסיטוע, א. שניאורסון, ע. עמיצור, א. ערב. (2004) הזרעה מלאכותית בעזים עם זירמה קפואה. הנוקד, גיליון מס' 41, ע' 24-25.

 

2. Eppleston, J., Maxwell, W.M.C. 1993. Recent attempts to improve fertility of frozen ram semen inseminated into the cervix. Wool Technol. Sheep Breed. 41, 291-302.
3. Evans, G., Maxwell, WMC. 1987. Salomon’s artificial insemination in sheep and goats. Sydney, Australia: Butterworts. P. 114.
4. Gacitua H, Arav A. 2005. Successful pregnancies with directional freezing of large volume buck semen. Theriogenology 63(3):931-938.
5. Polge C, Smith AV, Parkes AS. 1949. Revival of spermatozoa after vitrification and dehydration at low temperatures. Nature 164:666.
6. Salomon, S., Maxwell, W.M.C. 1995b. Frozen storage of ram semn. II. Causes of low fertility after cervical insemination and methods of improvement. Anim. Reprod. Sci. 38,1-36.
7. Watson PF. 2000. The causes of reduced fertility with cryopreserved semen. Animal Reproduction Science 60-61:481-492.
.

לכל המבזקים....
office@milk.org.il פקס: 972-3-9564766 טל: 972-3-9564750 דרך החורש 4 , ת"ד 97, יהוד 5647003
מופעל באמצעות מעוף - מגוון אפקט