דו"ח מסכם לתכנית 362-0152-09

 

זיהוי מוקדם של הסיכוי לפתח מחלות דרכי נשימה (BRD) בבקר

 

מגישים: אריאל שבתאי1, יעקב ויה2, מאורי רוזן3, אריה ברוש1 ומרדכי ולדמן4

1 היחידה לבקר לבשר, נווה יער, מינהל המחקר החקלאי

2 מיג"ל – הגליל העליון

3 שה"מ

4 החקלאית  

 

 

תקציר

קומפלקס מחלות דרכי הנשימה בבקר (BRD) אשר נגרם עקב שינויים חריפים בממשק הבקר ועקב העברתו ממקומו, הינה מחלה המאופיינת בשינוי תלוי-עקה ברגישות של דרכי הנשימה לפתוגנים וירליים וחיידקיים. ההפסדים הכלכליים השנתיים הנגרמים בשל תמותה או תחלואה מ – BRD נאמדים בארה"ב ב- 600-700 מיליון דולר. בישראל מתווסף הנזק של פגיעה ברמת הכשרות של הבשר, והפסדים שנתיים של כ– 23 מיליון ₪ למגדלים. כיום לא קיימים האמצעים להערכה מוקדמת של רגישות העגלים לתחלואה. בנוסף, בדיקות היסטופתולוגיות (סירכות) בטבחות עגלי פיטום מצביעות על ליקויים ריאתיים בכ 50% מהעגלים שלא אובחנו וטופלו בחייהם. משמעות הדבר היא שליקויים ריאתיים קורים גם אם לא נצפתה דלקת ריאות. עובדות אלה מצביעות על הצורך בזיהוי אובייקטיבי מוקדם של הסיכון של עגלים לחלות ב – BRD, כדי לאפשר טיפול מונע יעיל שימזער את הנזקים הכרוכים במחלה. זיהוי התחלואה  בשלב התפרצות המחלה, מאפשר לרוב לרפא את בעל החיים ולמזער את הנזקים הפיסיולוגיים והבריאותיים, אך הנזקים הכלכליים הנלווים המצטברים עדיין גדולים מאוד. בנוסף, הטיפול במחלה לאחר שפרצה, לא ימנע בחלק גדול מהמקרים את היווצרות הסירכות וכתוצאה מכך את הפגיעה בכשרות הבשר.

התוצאות המוצגות בדו"ח זה רומזות כי ניתן לחזות את הסיכון לפתח נזקים ריאתיים בעגלים צעירים, שבעה ימים לאחר העברתם ממקומם, על בסיס מרקרים להערכת עקה חמצונית וביטוי של גנים בנויטרופילים. עוד עולה מדו"ח זה כי קיימת תגובה אינדיבידואלית לעקת העברה בקרב עגלים צעירים – בעוד שחלק מהעגלים מגיבים להעברה ע"י הגברת הביטוי של חלבוני עקה, עגלים אחרים חסרי תגובה שכזאת. הקשר בין התגובה לעקה לבין התפתחות של נזקים ריאתיים צריכה להיבחן.

 

מבוא

קומפלקס מחלות דרכי הנשימה בבקר, המכונה בשם כללי (Bovine Respiratory Disease; BRD) ונגרם פעמים רבות עקב שינויים חריפים בממשק הבקר ובעקבות העברתו ממקומו (“Shipping fever”), גורם לשני שלישים ממקרי התחלואה ולכ- 10% ממקרי התמותה של בני בקר (1-2). BRD הינה מחלה בעלת אטיולוגיה רב-גורמית (פיסיקלית, ביולוגית, כימית ופסיכולוגית, לחוד או בסינרגיזם), המאופיינת בשינוי תלוי-עקה ברגישות של דרכי הנשימה לפתוגנים וירליים וחיידקיים, אשר בנסיבות רגילות מאכלסים את מערכת הנשימה העליונה בעגל (3) אך אינם מסכנים אותו. הפתוגנים הללו משגשגים בחלקה התחתון של מערכת הנשימה תוך ניצול מצב העקה שמצויה בו מערכת החיסון (3-4), כתוצאה מגמילה ו/או טרנספורט, ערבוב קבוצות, שונות גיל בחצר הגידול, גורמי אקלים, גזים ואבק באוויר ועוד. מהות הנזק הפיסיולוגי של המחלה הוא בגרימת הדבקויות של קרומי הריאה, מה שמוליך לסתימה חלקית או מוחלטת של נאדיות הריאה ודרכי האוויר המובילים אליה. הפגיעה בפונקציונאלית של הריאה והשלכותיה על המטבוליזם, כמו גם הפגיעה בתיאבון של העגלים גוררות ירידה ניכרת ביצרנות. זאת, בתוספת להוצאות הטיפול במחלה מסבים למגדלים הפסדים שנתיים כבדים. ואכן, ההפסדים הכלכליים השנתיים הנגרמים בשל תמותה או תחלואה מ – BRD נאמדים בארה"ב ב- 600-700 מיליון דולר. בישראל מתווסף הנזק של פגיעה ברמת הכשרות של הבקר, והפסדים שנתיים של כ– 23 מיליון ₪ למגדלים. כיום, האמצעים להערכה מוקדמת של רגישות העגלים לתחלואה לא קיימים כלל והזיהוי של המחלה בשלביה המוקדמים הם סובייקטיביים ומערבים הערכה ויזואלית הנתמכת במדידות קליניות מועטות. זיהוי התחלואה  בשלב התפרצות המחלה, מאפשר לרוב לרפא את בעל החיים ולמזער את הנזקים הפיסיולוגיים והבריאותיים אך הנזקים הכלכליים הנלווים המצטברים עדיין גדולים מאוד. בדיקות היסטופתולוגיות (סירכות) בטבחות עגלי פיטום מצביעות על ליקויים ריאתיים ב- 37-68% מהעגלים שלא אובחנו וטופלו בחייהם (5-6). משמעות הדבר היא שליקויים ריאתיים קורים גם אם לא נצפתה דלקת ריאות.

 

עובדות אלה מצביעות, ללא ספק, על הצורך בזיהוי אובייקטיבי מוקדם של הסיכון של בעל חיים לחלות ב – BRD, כדי לאפשר טיפול מונע יעיל שימנע את הנזקים הכרוכים במחלה.

במהלך שלוש העשורים האחרונים הולכות ומצטברות ראיות הקושרות, נסיבתית, בין התפתחות BRD ועקה  חמצונית (7-9). בהתבסס על התוצאות הנ"ל, קיים ניסיון בשנתיים האחרונות להערכת הקשר בין גורמים המאיצים BRD וסמנים ביולוגיים אנדוגניים לעקה חמצונית. מאחר ועקה חמצונית במתכונת של סמנים ביולוגיים אנדוגניים היא פועל יוצא של מגוון רחב של עקות, נדרש, לעניות דעתנו, סמן בעל "טביעת אצבע" ספציפית לסוג העקה. סמנים אקסוגניים שכאלה, רגישים ל- RNS/ROS, פותחו זה מכבר ע"י פרופסור יעקב ויה במיג"ל. הסמנים בנויים מיחידות אנדוגניות כמו חומצה אמינית טירוזין (לזיהוי פגיעה בחלבון) המחוברת לחומצה לינולאית (לזיהוי פגיעה בליפידים) ואלה קשורות במידת הצורך ליחידה שלישית כמו גואנוזין (לזיהוי פגיעה ב- DNA ) או כולסטורול (זיהוי פגיעה בסטרולים), כאשר כל היחידות הללו מחוברות בקשר קוולנטי זו לזו. הדגרה של אחד הסמנים הללו עם דוגמה ביולוגית (דם, רקמה, תאים, רוק) המצויה במצב של עקה חמצונית תגרום לפגיעות בסמן ושינויים במבנה שלו (חמצונים שונים בכל אחד ממרכיביו) בהתאם לסוג העקה המצויה במערכת הנבדקת. כתוצאה מכך עשויה להיות קורלציה בין סוג העקה הקיימת במערכת לבין סוג הפגיעה בסמן, או בין סוג המצב הפתולוגי המתפתח בייצור ממנו לקוחה הדוגמה לבין סוג השינוי שחל בסמן, ובאופן כזה קבלת טביעת אצבע של המחלה בסמן.

 

מטרת המחקר: פיתוח אמצעי לזיהוי אובייקטיבי וספציפי מוקדם של הסיכון לחלות ב – BRD, כדי לאפשר טיפול מונע יעיל להקטנת התחלואה ולשיפור רמת הכשרות והיצרנות של עגלי בקר לבשר.

 

שיטות וחומרים

25 עגלי הולשטיין, בני 7-4 ימים, הועברו לאחר המלטה ברפת בית דגן ליונקיה בנוה יער, במספר מועדי העברה. העגלים טופלו במשך 5 הימים הראשונים להגעתם ב- Pen-Strep. שנים עשר עגלים שמשו לבחינת התגובה קצרת הטווח לעקת העברה, דרך השינוי בביטויים של חלבוני עקת חום (Hsp). שלושה עשר עגלים נבחנו בטווח הארוך יותר לשינוי במדדים של עקת חמצון, קרי תוצר חמצון של הסמן LT.

20 מ"ל של דם נלקחו מכל 25 העגלים שלושה ימים לפני העברתם (ברפת בבית דגן) וכן שעה, 5 שעות ויום לאחר העברה בניסויי הטווח הקצר ו- 1, 4, 7, 10 ימים לאחר הגעתם ליונקיה בנוה יער בניסויי הטווח הארוך. 1 מ"ל נלקח לתוך מבחנה עם הסמן האקסוגני LT (חומצה לינולאית – טירוזין). הדם הודגר ב- 37oC למשך שעה, מוצה לתוך תערובת ממסים אורגניים (הקסן: איזופרופנול), ומצב החמצון של הסמן (הופעתם של תוצרי חמצון של הסמן) פוענח באמצעות GC/MS, LC/MS/MS. 1 מ"ל של הדם שימש להפקת RNA. ה RNA מוצה ע"י TRI REAGENT בהתאם להוראות היצרן וטופל ב RNase-free DNase  להסרת זיהום של DNA. כמות ה RNA ואיכותו נקבעו בעזרת Nanodrop ND-1000 ובג'ל, בהתאמה. 2ml של RNA שימשו ליצירת cDNA ע"י Superscript II Reverse Transcriptase kit (Invitrogen), בהתאם להוראות היצרן. השינויים בביטוי תוצרי הגנים Hsp60, וbetaglycan  נקבעו ע"י semi-quantitative RT-PCR.

 

תוצאות

השפעת עקת העברה בטווח הקצר: רמות הביטוי של Hsp60, בתגובה לעקת העברה מופיעות באיור 1. ניתן לראות תגובות אינדיבידואליות להעברה בקרב עגלים שונים; בעוד שעגלים מסוימים הגבירו את רמת הביטוי של Hsp60, בעגלים אחרים לא נצפה שינוי. ההחלטה על שינוי ברמת הביטוי נקבעה כיחס בין רמת הביטוי בזמן מסוים לאחר ההעברה לרמת הביטוי לפני ההעברה (0d). כאשר יחס זה היה קטן מ 1.5, נקבע כי לא הייתה תגובה. עגלים בהם היחס היה גדול מ 1.6 נחשבו כעגלים מגיבים. בו בזמן שבחמישה מתוך 12 העגלים לא השתנתה תבנית הביטוי של Hsp60 בתגובה להעברה, בשבעה עגלים נרשמה עלייה, שעה, 5 שעות ויום לאחר ההעברה. בשל "קשיחות סטטיסטית" שננקטה על ידינו, בגלל חזרות על מבחן t דו-זנבי, בצענו תיקון Bonferroni, שבעקבותיו רמת המובהקות נקבעה על 1.7% ולא 5%. למרות התיקון, ההבדלים ברמת הביטוי של Hsp60 בין עגלים מגיבים ללא מגיבים, היו מובהקים שעה, 5 שעות ויום לאחר ההעברה (איור 1).


 

 איור 1: שונות ברמת הביטוי של הגן HSP60 בעקבות העברת עגלים ממקומם (שעתיים של נסיעה במשאית). התוצאות מוצגות כממוצע + שגיאת תקן והן מובעות ביחס לאקטין (גן מנרמל). ערכי P מעל העמודות מציינים הבדלים מובהקים בין עגלים מגיבים ללא מגיבים. כוכבית מציינת הבדלים מובהקים לאחר תיקון Bonferroni. 0d – לפני ההעברה.

 

 

 

השפעת עקת העברה בטווח הארוך: בדו"ח של השנה הראשונה הוצגו תוצרי החמצון של הסמן האקסוגני LT. התוצרים שהתקבלו היו אפוקסיד של המרכיב של החומצה הלינולאית בסמן, הידרופראוקסיד שלה ותוצר לא מזוהה בעל יחס m/z=526.8. בשנה השנייה עקבנו אחר השינוי בריכוזי תוצר החמצון LT-526.8, 1, 4, 7, 10 ימים לאחר העברה. כמו כן בקשנו לבחון האם קיים מתאם בין השינוי בריכוזו בפרקי זמן אלו לבין ליקויים ריאתיים (סירכות) מאנליזות בבית המטבחיים, בגיל שנה. התוצאות הראו כי ריכוזי תוצר החמצון LT-526.8 בעגלים הצעירים 4, 7 ו 10 ימים לאחר ההעברה היו גבוהים באלה שנמצאו טרפים בבית המטבחיים, בגיל שנה. אולם גם כאן בצענו תיקון Bonferroni בגלל ריבוי של מבחני t דו-זנביים. מתוצאות התיקון עולה שלמרות השינויים המשמעותיים בריכוז תוצר החמצון, ההבדלים לא היו מובהקים. יחד עם זאת, ראוי לציין כי ריכוז התוצר LT-526.8 הולך ויורד בעגלים הכשרים עם ההתרחקות מיום ההעברה (r = -0.98 P=0.004) והולך ועולה בעגלים הלא כשרים (r = 0.99 P=0.001). בשנה הנוכחית אנו מביאים את תוצאות האנליזה של תוצרי החמצון LT-epoxide ו LT-hydroperoxide (איורים 2, 3).

 

איור 2: היכולת של ריכוז תוצר החמצון LT-epoxide בעגלים צעירים לאחר העברה לחזות כשרות (סירכות ריאתיות) בשחיטה, בגיל שנה. התוצאות מוצגות כממוצע + שגיאת תקן. ערכי P מעל העמודות מציינים הבדלים מובהקים בריכוז LT-epoxide בין עגלים כשרים לטרפים.

 

 

 

איור 3: היכולת של ריכוז תוצר החמצון LT-hydroperoxide בעגלים צעירים לאחר העברה לחזות כשרות (סירכות ריאתיות) בשחיטה, בגיל שנה. התוצאות מוצגות כממוצע + שגיאת תקן. ערכי P מעל העמודות מציינים הבדלים מובהקים בריכוז LT-hydroperoxide בין עגלים כשרים לטרפים.

 

 

ריכוזם של שני תוצרי חמצון אלו היה גבוה יותר בעגלים הלא כשרים בכל נקודות הזמן, למעט LT-epoxide לפני ההעברה ו LT-hydroperoxide 4 ימים לאחר ההעברה.

באיור 4 ניתן לראות את השפעת עקת ההעברה של עגלי הולשטיין צעירים על רמת הביטוי של הגן betaglycan בנויטרופילים. בניגוד לגנים אחרים שבדקנו בנויטרופילים, פרו-דלקתיים בטבעם, שרמתם ירדה בעקבות ההעברה (תוצאות לא מוצגות), רמת הביטוי של betaglycan שהינו גן אנטי-דלקתי, עולה באופן מובהק לאחר ההעברה. רמת הביטוי של betaglycan בעגלים הצעירים שבעה ימים לאחר ההעברה נמצאה במתאם עם הכשרות בבית במטבחיים, בגיל שנה. רמת הביטוי של גן זה הייתה גבוהה יותר בעגלים שנמצאו כשרים בבית המטבחיים (t9=3.25, p=0.01).

 

איור 4: השינוי בביטוי של הגן betaglcan בעקבות העברת עגלים ממקומם. התוצאות מוצגות כממוצעים ± שגיאות תקן. האותיות מעל העמודות מציינות הבדלים מובהקים בין הטיפולים.

 

על בסיס הנתונים הנ"ל בצענו אנליזה מבדלת כדי לקבוע את רמת הדיוק שבה תוצרי החמצון של הסמן LT והגן betaglycan יוכלו להבדיל בין עגלים כשרים ולא כשרים. ארבעת המשתנים הנ"ל נכללו באופן בלתי תלוי באנליזה המבדלת כדי לקבוע מי מהם משקף בצורה הטובה ביותר את ההבדלים בין כשר לטרף, כלומר, מי מהם ממקסם את מספר החיוביים האמיתיים וממעיט את מספר ה false positive. באנליזה מקדימה, מצאנו כי הפונקציה המבדלת מתקיימת בצורה הטובה ביותר שבעה ימים לאחר ההעברה. המשואה המבדלת שהתקבלה שבעה ימים לאחר העברה הינה:

 Y = 37.696 x LT-hydroperoxide + 3.673 x LT526.8 + 0.4 x LT-epoxide – 2.298 x betaglycan – 4.47

מתוך המשואה, הצנטרואיד של עגלים כשרים ממוקם באזור השלילי (-2.57) והצנטרואיד של עגלים טרפים באזור החיובי (2.14).

 

דיון ומסקנות

אחוזי הכשרות הכללים בארץ של עגלים מגזע הולשטיין הם כ 30%. לאור הממצאים שקבלנו בשנתיים החולפות אנו סבורים כי קיימת שונות גנטית המצויה בבסיס ההבדלים האינדיבידואליים הללו. מחקרים רבים הראו כי העברת עגלים פוגעת בתפקוד מערכת החיסון (3, 10- 13). מחקרים רבים אחרים דווחו על הקשר שבין עקה לירידה בביצועי מערכת החיסון ולפתולוגיות שונות (ובכללן מחלות נשימה), כמו גם על קשר (נסיבתי, בשלב זה) בין העברת עגלים לבין התפתחות עקת חמצון (9). העברת עגלים נחשבת עקה המהווה זרז לתחלואה בדלקת ריאות. הקשר הזה העברה (עקה) – עקת חמצון – שינוי בתפקוד מערכת החיסון – תחלואה אינדיבידואלית בדלקת ריאות, בנוסף לעובדה שאין כיום אמצעי לחיזוי מוקדם של סיכוי של עגל לחלות בדלקת ריאות, מעוררים את הצורך בפיתוח של אמצעי זיהוי כזה. ניתוח של הנתונים הרבים המצויים בספרות רומז כי יש לחפש אמצעי שכזה במערכות המתמודדות עם עקה. ואכן, לאור התוצאות של מחקרנו בשנים האחרונות (כולל בשנה החולפת) מסתמן כי עגלים נבדלים בתגובתם האינדיבידואלית לעקת העברה, אם ע"י הבדלים ברמות הקורטיזול המופרש ואם בביטוי של חלבוני עקה. Hsp, בנוסף לתפקודם הידוע כצ'פרונים תוך-תאיים המגנים על חלבונים מפני נזקים המובילים לדנטורציה ואגרגציה, ידועים גם כפקטורים המאותתים על סכנה למערכת החיסון, כשהם מופרשים או משתחררים מהתאים. הם נקשרים לתאים המערכת החיסון המולדת כשם שעושה LPS, טוקסין של חיידקים ומעוררים תגובה דלקתית מקומית. יתכן כי ההבדל בין עגלים עם נזקים ריאתיים (סירכות) לבין עגלים חלקים נעוץ בתגובה לעקה בתווך Hsp בגיל הצעיר. השערה זאת צריכה להיבדק, ואם היא תסתבר כנכונה היא יכולה להסביר מקרים רבים של טריפה למרות חוסר סימפטומים של תחלואה בדלקת ריאות בגיל הצעיר.

התוצאות המובאות בשנה זאת רומזות כי ניתן, על פי מדדים של עקה חמצונית וביטוי גנים במערכת החיסון, לחזות מוקדם, ברמת מובהקות גבוהה, את הסיכון לחלות בדלקת ריאות קלינית ותת-קלינית. יחד עם זאת, תוצאות אלו צריכות להיבחן על מספר הרבה יותר גדול של עגלים כדי לאושש את המודל המוצע.

 

ספרות מצוטטת

(1) אורי בר גיא (1998). מחלות  בקר בישראל – היבטים קליניים, משקיים, כלכליים ומניעתם. הוצאת אקדמון, מהדורה שנייה.

 

 

(2) Wiske, S. E. (1985). Feedlot cattle pneumonias (Symposium on Bovine Respiratory Disease). Vet. Clin. North America: Food Anim. Prac. 1(2): 289-310.

 

(3) Roth, J. A. and Perino, L. J. (1998). Immunology and prevention of infection in feedlot cattle. . Clin. North America: Food Anim. Prac 14(2): 233-255.

 

(4) Muggli-Cockett, N. E., Cundiff, L. V. and Gregory, K. E. (1992). Genetic analysis of bovine respiratory disease in beef calves during the first year of life. J. Anim. Sci. 70: 2013-2019.

 

(5) Gardner, B. A., Dolezal, H. G., Bryant, L. K., Owens, F. N. and Smith, R. A. (1999). Health of finishing steers: Effects on performance, carcass traits and meat tenderness. J. Anim. Sci. 77: 3168-3175.

 

(6) Wittum, T. E., Woolen, N. E., Perino, L. J. and Littledike, E. T. (1996). Relatioship among treatment for respiratory tract disease, pulmonary lesions evident at slaughter, and rate of weight gain in feedlot cattle. JAVMA 209: 814-818.

 

(7) Hays, V. S., Gill, D. R., Smith, R. A. and Ball, R. L. (1978). The effect of vitamin E supplementation on performance of newly received stocker cattle. Oklahoma state University Anim. Sci. Res. Report MP-199: 198-201.

 

(8) Hutcheson, D. P. and Cole, N. A. (1985). Vitamin E and selenium for yearling feedlot cattle. Fed Proc. 44: 549 (abstract).

 

(9) Chirase, N. K., Greene, L. W., Purdy, C. W., Loan, R. W., Auvermann, B. W., Parker, D. B., Walborg, E. F. Jr, Stevenson, D. E., Xu, Y. and Klaunig, J. E. (2004).

Effect of transport stress on respiratory disease, serum antioxidant status, and serum concentrations of lipid peroxidation biomarkers in beef cattle. Am. J. Vet. Res. 65(6): 860-864.

 

(10) Blecha, F., Boyles, S. L. and Riley, J. G. (1984). Shipping suppresses lymphocyte blastogenic responses in Angus and Brahman Angus feeder calves. J. Anim. Sci. 59(3): 576–583

 

(11) Gupta, S., Earley, B. and Crowe, M. A. (2007). Effect of 12-h road transportation on physiological, immunological, and haematological parameters in bulls housed at different space allowances. Vet. J. 173: 605-616.

 

(12) Murata, H., Takahashi, H. and Matsumoto, H. (1987). The effects of road transportation on peripheral blood lymphocyte subpopulations, lymphocyte blastogenesis and neutrophil function in calves. Br. Vet. J. 143: 166–174.

 

(13) Yagi, Y., Shiono, H., Chikayama, Y., Ohnuma, A., Nakamura, I. and Yayou, K.-I. (2004). Transportation stress increases somatic cell counts in milk, and enhances the migration capacity of peripheral blood neutrophils of dairy cows. Clin. Pathol. 66(4): 381–387.

 

לכל המבזקים....
office@milk.org.il פקס: 972-3-9564766 טל: 972-3-9564750 דרך החורש 4 , ת"ד 97, יהוד 5647003
מופעל באמצעות מעוף - מגוון אפקט