טפול חדשני בדלקות עטין כרוניות וכטיפול מניעתי בתקופת היובש
תכנית: 354-141-03

דוח סופי: שנה ג

נסים סילניקוב, המכון לבע"ח, מינהל המחקר החקלאי

תקציר

עבודות מחקר בסיסית על תהליכי הייבוש של פרות הביאה לרעיון לפתח תרופה וטרינרית לטיפול בדלקות עטין ע"י חיקוי וזירוז התהליך הטבעי המתחולל בעטין בעת ייבושו. מטרות העבודה העיקריות היו: 1. לבחון את יעילות התכשיר לחסל זיהומים בחיידקים שונים של העטין ע"י יבוש ספציפי ועירור מערכת החיסון ברבע העטין הנגוע 2. להקטין את מספר התאים הסומאטים בחלב המשווק מהפרה המטופלת. התוצאות הראו שבכל הפרות הביא הטיפול ליבוש הרבע המטופל. כתוצאה מכך, קטן בצורה דרסטית מספר התאים הסומאטים מרמה המאפיינת פרה נגועה בחיידקים לרמה של חלב באיכות מעולה. ב-80% של המקרים היה  הרבע המטופל נקי מהחיידק בו היה נגוע, או מחיידקים אחרים. ההצלחה של הטיפול הודגמה כלפי מגוון רחב של חיידקים הגורמים לדלקות עטין. ההצלחה המרשימה של הטיפולים הביאו לרכישת הידע ע"י חברה מסחרית כדי לפתחו לכדי תרופה וטרינרית לטיפול בדלקות עטין.


Abstract
Accumulation of casein-derived peptides to critical concentration in milk stored in the mammary gland induces the process of mammary involution in the gland. The ability of casein hydrolyzates (CNH) to dry-off milk secretion in infected mammary quarters and cure microbial infection was evaluated. Lactating cows, infected by various common pathogens in one quarter and having an average SCC of 2,000,000 were treated. An infected quarter was infused with 10 ml of CNH (prepared under GMP conditions) three consecutive times, 24 h apart, after milking, Treatment accelerated and synchronized the natural involution process as reflected by rapid dry-off of milk secretion in 35 out of 37 cows within 3 days. Dramatic changes in the composition of mammary secretion: disappearance of lactose and fat and accumulation of whey proteins with components of the innate immune system were observed. The bactericidal activity of mammary secretion of treated glands, which started within 8 h, persisted after the 3 day course of CNH treatments protocol. Immediate success resulting in SCC of less than 400,000 in the three functional glands in post-treated cows was 85%. After parturition, 78% of the treated quarters were bacteria free.  Thus, CNH appears as an effective tool to improve milk hygiene in cows exposed to subclinical and chronic mastitis and to eliminate bacterial infection. The latter properties of CNH treatment also suggest that it may be used as an effective non-antibiotic dry treatment for cows.

 

מבוא
דלקת עטין גורמת נזק כלכלי רב למגדלי בקר לחלב. הנזק מוערך ב כ- 10% מכלל הערך הכספי של ייצור החלב. בארצות הברית הנזק לחקלאים כתוצאה מדלקת עטין מוערך בכ- 2 מיליארד דולר לשנה.

לדלקות העטין מופע קליני, התבטא בסימנים קלאסים של דלקת כגון אדמומיות, כאב וחום ברמה של העטין ואף ברמה של הפרה, ירידה בתאבון וירידה בייצור החלב והפרשה של כמות מסיבית של לויקוציטים לחלב.  בארצות הברית הנזק לחקלאים כתוצאה מדלקת עטין מוערך בכ- 2 מיליארד דולר לשנה.

המופע התת-קליני של המחלה שאינו מתבטא בסימני חיצוניים של דלקת הינו הגורם השכיח ביותר לדלקות עטין בפרות. דלקות עטין תת-קליניות גורמות לירידה בייצור ותפוקת גבינה (6). הסיבה העיקרית לירידה בתפוקת גבינה מעטינים נגועים היא עלייה בפרוק קזאין כתוצאה מפרוק אנזימטי מוגבר. מתברר שהאנזים העיקרי האחראי לפרוק קזאין הנו פלזמין. הפלזמין מצוי בחלב במצב בלתי פעיל (זימוגן) כפלזמינוגן. ההפיכה של פלזמינוגן לפלזמין פעיל מבוקרת ע"י פלזמין אקטיבטורים, שהם בעצמם אנזימים, החותכים את  הפלזמינוגן באתר ספציפי ומשחררים מתוכו פלזמין פעיל (1-2).


בעבודה שנעשתה לאחרונה במכון לבע"ח במרכז וולקני זוהו מרכיבים הנוצרים בחלב בזמן ייבוש וגורמים  להשריה של תהליך בלתי הפיך של ייבוש העטין ( אינוולציה) ברבע המטופל (1-2). ע"י הפקת חומרים אלו מהחלב אנו מסוגלים כיום להשרות אינוולציה של רבע העטין המטופל בכל מצב נתון ע"י החדרת כמות מתאימה של החומר הפעיל לעטין בטפול בודד, או במספר טפולים תוך כדי חליבת הרבע הנגוע (2-3). כושר זה מקנה אפשרויות חדשות לטפל בדלקות עטין קשות וכרוניות במצבים שהטיפול הקונבנציונאלי עד עתה נכשל, או הביא לאיבוד היכולת לייצר חלב ברבע הנגוע (3-4). בעבודות הקדמיות טופלו בהצלחה  בשיטה החדשה דלקות עטין הנגרמות ע"י חיידק מוגלתי (קורינובקטריום פיוגנס), ודלקות עטין כרוניות שבהם רבע נגוע לאחר הטיפול האנטיביוטי מפריש למעלה ממיליון תאים סומאטים למ"ל וגורם לזיהום כללי של טנק החלב במשק. בעזרת טפולים אלו הצלחנו לייבש הרבע הנגוע, לרפא את  הדלקת ולהקטין  את הזיהום של טנק החלב בתאים סומאטים בלמעלה מ- 90%  של המקרים (4). עד לרגע כתיבת הדוח טופלו  בתהליך החדש  8 פרות עם קורינובקטריום פיוגנס, ו   42 פרות עם זיהומים בקטריאליים שונים כגון נוקרדיה וסטפילוקוקים. תוצאות מהמקרים הקלינים מצביעים על פוטנציאל רב הגלום בשיטה זו הן  לטפול בדלקות עטין כרוניות.

 

מטרת העבודה
מטרות העבודה העיקריות היו:
 1. לבחון את יעילות התכשיר לחסל זיהומים בחיידקים שונים של העטין ע"י יבוש ספציפי ועירור מערכת החיסון ברבע העטין הנגוע
 2. להקטין את מספר התאים הסומאטים בחלב המשווק מפרות מטופלות

 

חומרים ושיטות
התכשיר הניסויי המבוסס על קזאין הידרוליזט (ק"ה) ומכונה "אינוולט" הוכן בתנאי GMP במעבדת הי-לאב ברחובות. בדיקות איכות הראו שהתכשיר סטרילי ונקי מחומרים פירוגנים (3). הפרות שטופלו, היו פרות שהפרישו מספר רב של תאים סומאטים ודגימות החלב היו נגועות בחיידקים. נגיעות העטין לפני הטיפול נקבעה לפי 2 בדיקות בקטריאליות במרווח של שבועיים במעבדה הרפרנטית הלאומית למחלות עטין (מעבדתו של דר. לייטנר) לפי תקן בין לאומי וכפי שפורסם לאחרונה (6).. לאחר ההמלטה, נבדק מצב הנגיעות הבקטריאלית באותם שיטות עד כדי 100 יום לאחר ההמלטה  במרווח זמן של כפעם לחודש.
הפרות טופלו לפי הפרוטוקול הבא:
1) ריקון הרבע לפני הטיפול
2) חיטוי הרבע המטופל כפי שמקובל בטיפול באנטיביוטיקה
3) החדרת מנה (בקבוק המכיל 10 מ"ל של חומר פעיל) לרבע המטופל בעזרת אפליקטור מיוחד לטיפול תוך עטיני
4) חזרה על התהליך במשך 3 ימים. אין לחלוב את הרבע המטופל בין הטיפולים  ולכן יש לסמנו בהתאם

נערך מעקב אחר התאים הסומאטים לאחר הטיפול, ולאחר ההמלטה העוקבת נערכו לפחות שתי בדיקות בקטריאליות לנוכחות חיידקים בחלב.


התוצאות נבחנו לפי המודל הסטטיסטי שלהלן:
 


ההבדלים בין הטיפולים נבחנו למובהקות סטטיסטית באמצעות המבחן הבא (6):  Tukey-Kramer Highest Significant Difference (HSD) test.

 

תוצאות

במשך 3 השנים האחרונות טופלו למעלה מ-100 פרות ברחבי הארץ כלפי אינדיקציות שונות מתוכן ב- 64 פרות נאגרו תוצאות מלאות; דהיינו, נערך מעקב אחרי הפרות עד להמלטה הבאה.
התוצאות מסוכמות בטבלאות 1 ו-2 להלן:

 

טבלה 1.  נגיעות בחיידקים לפני ואחרי הטיפול בק"ה

A- לפני הטיפול

מצב קליני

 

Agent

כרוני

קליני

סה"כ

Strep. dysg

13

11

24

E. Coli

3

4

7

Stap. Aureus

2

2

4

Other (1)

5

0

5

No detectable

3

0

3

Cor. Pyog.

(4)

20

20

סה"כ

26

17

63

B- אחרי הטיפול

 

 

 

Strep. Dysg.

2

1

3

E. Coli

1

0

1

Stap. Aureus       

0

1

1

Other (2)              

2

0

2

No detectable     

3

0

3

(4)Pyogenese     

 

0

0

סה"כl     

8

2

10

(1) Denotes Nocardia (n= 2), Pseudomonas (n= 1), Corynebacterium (n= 1), Micrococcus (n= 1). (2) Denotes Nocardia (n= 2). (4) Out of 15 cows

טבלה 2. תאים סומאטים לפני ואחרי הטיפול בק"ה

 

 

בטבלה 1 מוראה שהטיפול היה אפקטיבי בהורדת הנגיעות של מגוון רחב של חיידקים גראם חיוביים וגראם שלילים. ב-80% של המקרים הרבע המטופל היה נקי מהחיידק בו היה נגוע, או מחיידקים אחרים (טבלה 1).

התוצאות הראו שבכל הפרות הביא הטיפול ליבוש הרבע המטופל. כתוצאה מכך, קטן בצורה דרסטית מספר התאים הסומאטים מרמה המאפיינת פרה נגועה בחיידקים לרמה של חלב באיכות מעולה (טבלה 2).


בציור 1 מודגם האפקט של הטיפול בפרת חלב בודדת שטופלה בק"ה בסוף תחלובה השנייה לאחר שלתה בהדבקה כרונית בחיידק סטאף אאורוס באמצע התחלובה.

 

  

ציור 1: ייצור חלב בפרה שנדבקה בסטאף אאורוס במהלך התחלובה השנייה.

 

התוצאות מראות על החלמה של כושר ייצור החלב בתחלובה השלישית, לאחר שייצור החלב נפגע כתוצאה מהדבקה בחיידק. השיפור בייצור החלב היה מלווה בעלמות ההדבקה בחיידק.

בציור 2  מושווה ייצור החלב ב-100 יום הראשונים בתחלובה בה טופלו הפרות בהשוואה לייצור החב ב-100 יום הראשונים בתחלובה העוקבת. התוצאות מראות שהדוגמא המתוארת בציור 1 אפיינה את כל הפרות; דהיינו, הירידה במספר התאים הסומאטים בעקבות הטיפול בתחלובה העוקבת הייתה מלווה בשיפור בייצור החלב.

 

 

ציור 2: ייצור חלב ב-100 יום הראשונים בתחלובה בה טופלו הפרות בהשוואה לייצור חלב ב-100 יום הראשונים בתחלובה העוקבת.

 

דיון
מגוון רחב של גורמים יוצרים תגובה דלקתית כאשר הם מוחדרים לחלל העטין. בתכשירים טבעיים, כגון הק"ה קשה להיפתר מזיהומים באנדו-טוקסינים העשויים לגרום לתגובה דלקתית בלתי ספציפית וע"י למסך את הגובה הספציפית של החומר הנבחן. בעיה זו נפתרה על ידי הכנת החומר בתנאים מחמירים ובדיקה לנוכחות אנדוטוקסינים בתכשיר. בדיקת האיכות הראו שכמות האנדו-טוקסינים בתכשיר הייתה פי 2000 נמוכה מכמות האנדו-טוקסינים המותרת להחדרה תוך ורידית לבני אדם בתקן המחמיר של ה-FDA. ניתן לסכם, שהתגובות החיסוניות שעוררו ע"י הק"ה היו ספציפיות לתכשיר.

לו היה ניתן לרפות דלקות עטין ע"י אנדו-טוקסין זול וקל להכנה, כגון ליפו-פולי-סכריד המופק מחיידקי אשריכייה קולי, יש לשער שכבר מזמן הוא היה ניכנס לשימוש כיוון שהתגובות של מערכת החיסון לחומר זה ידועות היטב כבר זמן רב.

לכן מעניינת השאלה מה מייחד את התגובה החיסונית לק"ה ההופך אותה לכה יעילה כנגד זהום של מגוון כה רחב של חיידקים? תשובה מקיפה לשאלה זו מצריכה מחקר נוסף, אך מתוצאות המחקרים עד כה אנו מניחים שהיעילות של ק"ה בריפוי חיידקים נובעת מהפעלה מהירה ורבת עוצמה של מערכת החיסון המולדת המשלבת באופן מאוזן את מגוון התגובות האפשריות (1-5):
א. ייבוש מהיר של  ההפרשה של חלב וירידה דרסטית בריכוזים של חומרי מזון כגון לקטוף, שומן והופכת אותו למדיום דל-תזונתי לגידול חיידקים.
ב. הפרשה של חומרים אנטי-בקטריאליים, כגון לקטופרין ואימיונו-גלובולינים.
ג. חדירה מסיבית של לויקוציטים לחלל הבלוטה
ד. הפעלה של מערכות אנזימטיות (קסנטין אוקסידאז ןלקט-פראוקסידאז) היוצרים רדיקלים בקטריוצידים.


התוצאות המושגות בעקבות טיפול בק"ה הן מרשימות ביותר בהשוואה לתוצאות בטיפולים אנטיביוטיים או טיפולים אלטרנטיביים אחרים שבהם % ההצלחה ברוב המקרים קטן מ-50%.

פוטנציאל נוסף הגלום בשיטה שפותחה הנו שימוש בה כטיפול פרופילקטי (דהיינו, טפול סטנדרטי בכל הפרות בעדר) לייבוש פרות בתום התחלובה. אנו סבורים כי טפול זה יהיה יעיל במניעת מעבר זהום של חיידקים מתחלובה לתחלובה ויקטין במידה נכרת התפרצויות של דלקות עטין בתחילת התחלובה, כיוון שלמרכיבים המופקים מהחלב יש פעילות דמוית אנטיביוטיקה וכיוון שהטיפול מעורר את המערכת האימונולוגית של הפרה לפעילות מקסימאלית תוך זמן קצר.

 

סיכום
תוצאות המחקר הביאו לרכישת הידע ע"י חברה מסחרית כדי לפתחו לכדי תרופה וטרינרית לטיפול בדלקות עטין.


רשימת ספרות

1. Shamay, A., S. J. Mabjeesh, and N. Silanikove. 2002. Casein-derived phosphopeptides disrupt tight junction integrity, and precipitously dry up milk secretion in goats. Life Sci. 70:2707-2719.
2. Shamay, A., F. Shapiro, G. Leitner, and N. Silanikove. 2003. Infusion of casein hydrolyzates into the mammary gland disrupt tight junction integrity and induce involution in cows. J. Dairy Sci. 86:1250-1258.
3. Silanikove, N., F. Shapiro, A. Shamay, and G. Leitner. 2005a. Role of xanthine oxidase, lactoperoxidase, and NO in the innate immune system of mammary secretion during active involution in dairy cows: manipulation with casein hydrolyzates. Free Radic. Biol. Med. 38:1139-1151.
4 Silanikove, N., J. Iscovich, and G. Leitner. 2005b. Therapeutic treatment with casein hydrolyzate eradicate effectively bacterial infection in treated mammary quarters in cows. Pages 327–332 in Mastitis in Dairy Production: Current Knowledge and Future Solutions, H. Hogeveen, ed. Wageningen Academic Publishers, Wageningen, the Netherlands.
5. Silanikove, N., U. Merine, and G. Leitner. 2006. Physiological role of indigenous milk enzymes: An overview of an evolving picture. Int. Dairy J. 16: 533-545
6. Leitner, G., O. Krifucks, U. Merin, Y. Lavi, and N. Silanikove. 2006. Interactions between bacteria type, proteolysis of casein and physico-chemical properties of bovine milk. Int. Dairy J. 16:648-654

 
לכל המבזקים....
office@milk.org.il פקס: 972-3-9564766 טל: 972-3-9564750 דרך החורש 4 , ת"ד 97, יהוד 5647003
מופעל באמצעות מעוף - מגוון אפקט