מחקר מס' 226-0064-06


ביופילם מיקרוביאלי – חשיבותו של יצירת רובד חיידקי בהשראת דלקות עטין


חוקר ראשי: שמוליק פרידמן.
חוקרים נוספים: ש.סלע, א.קלמנט, נ.שפיגל, מ.פריד, ע.שווימר

 


מבוא ותאור הבעיה:
תחלואה בדלקות עטין מהווה בעיה קשה הגורמת להפסדים כלכליים משמעותיים במשק החלב בישראל ובעולם. המחלה יכולה להופיע בצורה קלינית אקוטית או כרונית או כהדבקה תת-קלינית וגורמת להפסדים עקב עלות הטיפול בפרה החולה, ירידה בתנובת ואיכות החלב, הוצאה מוקדמת מהעדר ולפעמים אף תמותה.
טיפול אנטיביוטי אם ניתן יכול להיות סיסטמי או תוך עטיני עם שיעור ריפוי משתנה אשר תלוי הן בגורם המחלה והן בפרה. נמצא כי גם במקרים בהם הטיפול האנטיביוטי מביא לריפוי קליני, שיעור ההצלחה הטיפולי המביא להעלמות החיידק לרוב אינו עולה על 60% (Hillerton et al 1995). מכאן ברור כי במקרים רבים דלקת העטין תחזור על עצמה באותו הרבע גם לאחר טיפול אנטיביוטי אשר הסתמן כמוצלח בהתחלה. קיומן של דלקות עטין חוזרות למרות טיפול הוא מעניין במיוחד לאור העובדה שרוב החיידקים הגורמים לדלקות עטין לא פיתחו עמידות משמעותית לאנטיביוטיקה (Erskine et al 2002). הסתכלות על מכלול הנתונים הללו מצביעה על כך כי החיידק הנמצא בעטין הוא בעל תכונות המאפשרות לו הישרדות בתנאים קשים והרחקתו מכמויות אנטיביוטיקה המספיקות לשם חיסולו המלא.
אחד ההסברים האפשריים לכך נעוץ ביכולתם של חיידקים רבים ליצור ביופילם. ביופילם הינה קהילת חיידקים עטופה בחומר פולימרי החיה בצימוד למשטח (חי או דומם). החיידקים המצויים בביופילם נבדלים זה מזה בתכונותיהם (עקב ביטוי של גנים שונים) בהתאם למיקומם בתוכו והם מסודרים כך שביניהם קיימות תעלות המאפשרות מעבר של חומרי מזון שונים. ההתארגנות בצורת ביופילם מאפשרת לחיידקים לשרוד בתנאים בהם יש חיכוך מתמיד ומגינה עליהם מפני מערכת החיסון ומפני חומרים אנטימיקרוביאלים. במקביל ליצירת ביופילם יש שחרור מתמיד של חיידקים לסביבה. חיידקים אלו הקרויים חיידקים פלנקטונים רגישים יותר לפעולת מערכת החיסון ולפעולתם של חומרים אנטימיקרוביאלים, אך יחד עם זאת הם ככל הנראה אלו הגורמים לסימנים הקליניים (Costerton et al 1999).


חשיבותו וייחודו של המחקר:
יצירת ביופילם הודגמה ב- S. aureus, S. epidermidis בזיהומים נוזוקומיאלים שונים, בזני סטרפטוקוקים שונים ביצירת רובד חיידקי על השיניים, אנדוקרדיטיס, דלקות ריאות ודלקת קרום המוח וב- E. coli בפרוסטאטיטיס ובזיהומים של צינורות המרה
(Donlan and Costerton 2002). רבים מן החיידקים הללו ידועים גם כגורמים של דלקות עטין בבקר. יכולת יצירת ביופילם ע"י חיידקי S. aureus אשר בודדו מדלקות עטין בבקר הודגמה במספר מחקרים בעבר (Cucarella et al 2004, Vasudevan et al 2003 ) ואף נמצא קשר בין ההסתמנות הקלינית ובין יכולת זו, כאשר חיידקים יוצרי ביופילם בודדו בשיעור גבוה יותר מדלקות עטין תת-קליניות מאשר מדלקות קליניות. מלבד המחקרים על חיידק זה לא ידוע לנו עד היום על ביצוע מחקר בהקשר ליצירת ביופילם ע"י חיידקים אחרים המעורבים בדלקות עטין. בעבודה זו נבחנה יכולת יצירת ביופילם בקרב חיידקי E. coli שהם מהחשובים ביותר כגורמי דלקות עטין במשק הבקר לחלב בישראל.
הבעיה הנוצרת עקב יכולתם של חיידקים ליצר ביופילם מוכרת כאמור בשטחים שונים בעולם הרפואה ועקב כך מושקעים מאמצים רבים בפיתוח טיפולים ספציפים כנגד יכולת זו באמצעים פרמקולוגים (Hentzer and Givskov 2003) או בשילוב עם טיפולים מכניים כגון שימוש בגלים אולטראסונים לשם פירוק הרובד החיידקי (Rediske et al 1999) . אנו מאמינים כי מחקר ראשוני זה יאפשר להבין מה מידת הבעיה בכל הנוגע בדלקות עטין בבקר לחלב בארץ ויאפשר בעתיד התוויית שיטות מניעה וטיפול טובות יותר למחלה חשובה זו.


מטרת המחקר:
העמדת מערכת הדירה לזיהוי יצירת ביופילם בחיידקי E. coli ומציאת שיעור החיידקים המייצרים ביופילם בקרב חיידקי E. coli המבודדים מדלקות עטין במשק הבקר לחלב בישראל.


מהלך המחקר:
אוכלוסיית המחקר:
חיידקים אשר בודדו מדלקות עטין מדגימות שנשלחו למעבדה של המערך הארצי לבריאות העטין ואיכות החלב (מועצת החלב-מאל"ה-קיסריה)


שיטה:
איסוף דגימות ושמירתן:
במעבדה לבריאות העטין מבצעים באופן שיגרתי בידודים של פתוגנים מדגימות חלב שנאספו מדלקות עטין. הדגימות נאספות ע"י יצרן החלב בעת חשד לדלקת עטין קלינית או תת קלינית, או באופן יזום ע"י דוגמי המעבדה בפרות תת-קליניות בהן ספירת התאים הסומטים גבוהה מ200,000 למ"ל .
הדגימות מבודדות על קרקע מזון Blood agar על גבי צלחות פטרי. במקביל, מתועדת סיבת הדיגום של הפרה במחשב (דלקת קלינית, תת קלינית).
לאחר זיהוי החיידק בשיטות הקלאסיות, נשמרו הצלחות בקירור עד להעברה של מושבה בודדת מכל צלחת לגליצרול. דגימה זו נשמרה בטמפרטורה של -70OC עד לביצוע אנליזה לבדיקת יכולת יצירת ביופילם.


בדיקת יצירת ביופילם:
בדיקת יצירת ביופילם בוצעה ע"פ פרוטוקולים ידועים כפי שפורסם בעבר (Cucarella et al 2004, Jackson et al 2003, Vasudevan et al 2003 ) אך בוצעו מודיפיקציות של התהליך כדי להתאימו לחיידקי E. coli.
תאור קצר של התהליך מובא להלן: לאחר איסוף של כמות מספקת של בידודים, הופשרו החיידקים והועברו למצע גידול LB וגודלו 24 שעות ב- 30OC ללא טלטול. החיידקים נמהלו ביחס 1:100 לתוך מצע LB חדש וגודלו בו ל- 24 שעות נוספות ללא טלטול. מבחנת האפנדורף נשטפה עם DDW לניקוי החיידקים אשר לא נקשרו. המשקע נצבע באמצעות CV (קריסטל ויולט) ולאחר שטיפה יובש. לאחר מכן המשקע מורחף באמצעות DMSO ו- 100 ul שלו נקראו ב- ELISA reader באורך גל של 570 nm. ב- 595 nm.


תוצאות:
טבלה 1 מתארת את ערכי ה- OD שהתקבלו ב- 51 בידודים. ניתן לראות בברור כי קיימים זני E. coli המייצרים ביופילם בעוד אחרים הם בברור נעדרי יכולת זו.


טבלה 1: ערכי OD ב- 51 בידודי E. coli שנדגמו מפרות בעת דלקות עטין


תרשים 1 מתאר את התפלגות התוצאות ב- 51 הבידודים אשר נבדקו. ניתן לראות בבירור כי כ- 6% מהחיידקים הם בעלי יכולת יצירת ביופילם משמעותית (OD>0.2). 60% מהחיידקים אינם מייצרים ביופילם כלל (OD<0.05) ובשאר קיימת קריאת ביניים לגביה צריך לערוך ברור נוסף.


תרשים 1: התפלגות קריאות OD במבחן יצירת ביופילם ב- 51 בידודי E.coli.


בהסתכלות על התוצאות במבחנות האפנדורף ניתן לראות אף הפרדה ברורה עוד יותר בין בידודים המייצרים ביופילם לכאלו שהם נעדרי יכולת זו (תרשים 2).


תרשים 2: מספר דוגמאות בהם נבדקה יצירת ביופילם. ניתן לשים לב להדירות הרבה של התוצאות (כל טור מהווה טריפליקט) וכן ליכולת האבחנה המעולה בין תבדיד המייצר ביופילם (3 משמאל) תבדיד שמייצר ביופילם ברמה בינונית (5 משמאל) ושאר התבדידים אשר אינם מייצרים ביופילם.

 

 

דיון:
העמדת מערכת הדירה ובעלת יכולת הבדלה טובה לשם בחינת יצירת ביופילם בחיידקי E.coli הושגה לאחר מאמצים רבים וניסויים על מאות בידודים של החיידק.
זהו המחקר הראשון בו מודגמת יכולת יצירת ביופילם בחיידקי E. coli אשר בודדו מדלקות עטין. חיידקים אלו מהווים מהגורמים החשובים ביותר לדלקות עטין קליניות בבקר ומחקר זה מהווה נדבך חשוב בתהליך הארוך המשמש להבנת הפתוגנזה של המחלה לה הם גורמים . יצירת ביופילם או דווקא אי יצירתו יכולים להוות מרכיב משמעותי במחלה לה הם גורמים. כפי שנכתב כבר, בחיידקי S. aureus נמצא כי יכולת זו קשורה דווקא בהסתמנות תת-קלינית של המחלה (Cucarella et al 2004). השלב הבא הוא כמובן לבדוק את התכונות הללו ולהשוותן לסימנים הקליניים המאפיינים את דלקות העטין השונות. בכך אנו עוסקים בעת הזו.
מתוצאות המחקר שלנו עולה כי יצירת ביופילם ברמה גבוהה היא תופעה נדירה בחיידקי E. coli ורק 6% הראו יכולת כזו בבירור. יחד עם זאת לא ברור האם החיידקים האחרים נעדרי יכולת כזו או שאינם מייצרים ביופילם מסיבות הקשורות בסביבת העטין הייחודית ממנה הם מבודדים. התכנון העתידי הוא לבדוק גם שאלה זו.


תודות
אני מודה לחוקרים אשר סייעו בביצוע עבודה ראשונית חשובה זו: ד"ר נחום שפיגל וד"ר אייל קלמנט ובייחוד לסטודנטים דביר מינץ, איילת כץ ומאיה בראל אשר השקיעו לילות כימים על-מנת להעמיד את המערכת המוצגת בדו"ח זה.
עבודה זו בוצעה בעזרת קרן המחקר לענף הבקר של מועצת החלב. מס. עבודה 226-0064


ביבליוגרפיה:

1. Costerton, J.W., Stewart, P.S., Greenberg, E.P., 1999. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318–1322.
2. Cucarella C, Tormo MA, Ubeda C, Trotonda MP, Monzon M, Peris C, Amorena B, Lasa I, Penades JR. , 2004. Role of biofilm-associated protein bap in the pathogenesis of bovine Staphylococcus aureus. Infect Immun. 72, 2177-85.
3. Donlan, R.M., Costerton, J.W., 2002. Bio.lms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin. Microb. Rev. 15, 167–193.
4. Erskine, R.J., Walker, R.D., Bolin, C.A., Bartlett, P.C., White, D.G., 2002. Trends in antibacterial susceptibility of mastitis pathogens during a seven-year period. J Dairy Sci. 85, 1111– 1118.
5. Jackson DW, Suzuki K, Oakford L, Simecka JW, Hart ME, Romeo T., 2002. Biofilm formation and dispersal under the influence of the global regulator CsrA of Escherichia coli. J Bacteriol. 184, 290-301.
6. Hentzer M, Givskov M., 2003. Pharmacological inhibition of quorum sensing for the treatment of chronic bacterial infections. J. Clin. Invest. 112, 1300–1307.
7. Hillerton, J. E., A. J. Bramley, R. T. Staker, and C. H. McKinnon. 1995. Patterns of infection over a 5-year period in a closely monitored herd applying mastitis control measures. J. Dairy Res. 62, 39–50.
8. Rediske AM, Roeder BL, Brown MK, Nelson JL, Robison RL, Draper DO, et al., 1999. Ultrasonic enhancement of antibiotic action on Escherichia coli biofilms: an in vivo model. Antimicrob Agents Chemother. 43, 1211-4.
9. Vasudevan, P., Nair, M.K., Annamalai, T., Venkitanarayanan, K.S., 2003. Phenotypic and genotypic characterization of bovine mastitis isolates of Staphylococcus aureus for bio.lm formation. Vet Microbiol. 92, 179–185.

לכל המבזקים....
office@milk.org.il פקס: 972-3-9564766 טל: 972-3-9564750 דרך החורש 4 , ת"ד 97, יהוד 5647003
מופעל באמצעות מעוף - מגוון אפקט