דוח סופי לתוכנית מחקר מס'   848-0328

 

בדודי  EHDV בישראל – אפיון תאי ומולקולרי במטרה לפתח תרכיב

 

מוגש קרן המדען הראשי -  משרד החקלאות -  מועצת החלב

ידין1 חגי, ארליך2 מרסלו,

1מכון וטרינרי ע"ש קמרון, בית דגן.

2מחלקה לחקר התא ואימונולוגיה, אוניברסיטת תל אביב, תל אביב.

               

 

תקציר המדעי של הדו"ח

מחלת דמם אפיזואוטית, Epizootic Hemorrhagic Disease (EHDV), מחלה נגיפית בבקר דווחה לראשונה בארץ בספטמבר 2006. נגיף ה- EHD שייך יחד עם נגיפי הלשון הכחולה (BT) לקבוצת ה- Orbivirus הידועים כנגיפיArbo  ומועברים על ידי יבחושים  Culicoides spp.  . התפרצות מחלת הדמם האפיזואוטית ב- 2006 ביותר מ-100משקים בבקעה ובעמק הירדן. גרמה לנזקים משקיים וכלכליים נרחבים.

תכנית המחקר הנוכחית מטרתה הרחבת הידע וההבנה של הגורם האטיולוגי למחלת ה- EHD, הוצע  לערוך אפיון של תהליכי ההדבקה, אפיון מולקולרי של הנגיף, ריצוף הנגיף והכנה של וקטורי ביטוי לחלבוני הנגיף תוך למוד תפקידם. כמו כן נכלל בתוכנית, למוד התהליך הציטופתי המושרה על ידי הנגיף מתוך מטרה לזהות את האתרים האחראים לאלימות ולאפקט הציטופתי של נגיף ה- EHDV.

תהליך ההדבקה של בידודי EHDV מקומיים הושוו עם נגיפי אורבי אחרים (בידוד ישראלי של Bluetongue 16, ו EHDV-2 מזן Ibaraki). בניסיון למייר את הנגיף, בוצעה סדרת העברות  של הנגיף ואלה אופיינו מבחינה מולקולרית תוך שאיפה להגיע למערכת של רוורס ג'נטיקס אשר תאפשר לפתח תרכיב חי בלתי אלים.

שיטות ומהלך העבודה – העבודה התבצעה במקביל בשתי מעבדות. מעבדת המכון הוטרינרי והמעבדה לביולוגיה של התא באוניברסיטת תל אביב. מעבדת המכון התמקדה בבידוד הנגיף ממקרים קליניים בארץ ומעבדתו של דר' ארליך התמקדה באפיון המולקולרי של הנגיפים, זו האחרונה התבססה על מגוון רחב של שיטות  הכוללות: ביולוגיה מולקולרית – Reverse Transcription ו -DNA cloning  ושיבוט של חלבוני הנגיף אל תוך mammalian expression plasmids. יצירת נוגדנים מונו- ופוליקלונליים כנגד החלבונים  הנגיפיים (NS2 ו-NS3non structural proteins 2 and 3). תאור מנגנון המוות התאי המושרה על ידי הנגיפים השונים. תוך שימוש במיקרוסקופיה פלואורצנטית ברזולוציה גבוהה – לאפיון תהליכי התגובה של הנגיף וחלבוניו עם התא.

סיכום תוצאות המחקר:  במהלך 2006 ו -2007 נבדקו 168 דגימות חשודות ל – EHD בניסיון לבידוד נגיף בהזרקה תוך ורידית לעוברי עופות בגיל 12 - 10 יום. 73 מהדגימות החשודות נתנו תמותה בביצים.  מתוך בידודים אלה,  28 נתנו אפקט ציטופטי בתרביות תאיBHK  . שלושה הוגדרו כ – EHD  על ידי המעבדה הרפרנטית ללשון הכחולה ו – EHD,  באנגליה. הנגיף שבודד עבר אפיון ברמת ההדבקה של תרביות תאים ובוצע גם plaque purification  (תמונה מס. 1). ואלה שמשו ומשמשים כבסיס למחקר ההשוואתי.

איפיון מנגנוני הפלישה: נמצא כי BTV-16 ו- EHDV-2 Ibaraki נכנסים אל תאי יונקים באמצעות אנדוציטוזה מתווכת קלטרין. מהלך האינפקציה: BTV-16, EHDV-2 Ibaraki  ו - EHDV7 הינם נגיפים ציטוליטים הגורמים למוות אפופטוטי של התאים ולארגון מחדש של הממברנות הפנימיות של התא. בנוסף לכל נגיף בנפרד תכונות האופייניות לו כגון:   BTV-16 משרה עצירת מחזור התא ב-   G2/Mוביטוי אקסוגני של  VP7, EHDV 2-Ibaraki משרה שינוים בארגון ובתוכן של ה -DNA  התאי (תמונה 8(.

 

מבוא

מחלת דמם אפיזואוטית, Epizootic Hemorrhagic Disease (EHDV), מחלה נגיפית בבקר לראשונה דווחה בארץ בספטמבר   2006 (18). נגיף ה- EHD שייך יחד עם נגיפי הלשון הכחולה (BT) לקבוצת ה- Orbivirus הידועים כנגיפיArbo  ומועברים על ידי יבחושים .Culicoides spp. המחלה הופיעה לאורך גבולה המזרחי של ישראל וגרמה לנזק כלכלי ניכר למשקי בקר רבים בעקר ברפתות החלב. ההתפרצות דווחה לראשונה במספר משקים בדרום עמק הירדן. תוארה ירידה של 10%- 20% בתנובת החלב, חוסר תאבון, פגיעה בתהליך העלאת הגירה, עלייה קלה בטמפרטורת הגוף, חולשה והליכה נוקשה. בנוסף הובחנה הפרשה רירית מהאף אשר הפכה מוגלתית, ריור יתר, דימומים בשפתיים, לשון כחולה, לעיתים גם נפוחה עם לקויות דמויות כיבים ולעיתים שטפי דם בלשון על קצות הפפילות. בנוסף הופיעו לקויות בעיניים שכללו לחמית היפראמית ועפעפיים בצקתיות.  המחלה התפשטה לכל אורך עמק הירדן עד עמק החולה ופרצה גם במשקים בעמק בית שאן, עמק יזרעאל , רמת הגולן והגיעה עד מישור החוף. סה"כ נרשמו מקרים קליניים ב- 105 עדרים, מהם 80 משקי חלב, 21 עדרי בקר לבשר ו- 4 מפטמות. התחלואה לעדר נעה בין 55- 80% במשקי החלב. משך התחלואה היה בין 3 ל- 30 יום והתמותה הייתה מזערית. מאותם אזורים בהם דווח על המחלה בבקר, לא היו כל דיווחים לגבי תופעות מחלה קלינית דומה במעלי גירה קטנים. בסיוע מעבדת הייחוס לכחול הלשון באנגליה, זוהה הגורם למחלה החדשה כ-  EHDV-7 ( 18 ).

ה – EHD, זו מחלה וירלית חריפה הפוגעת בחיות המשק בקר וכבשים, עקר פגיעתה בתנובת החלב, בחיות בר כאיילים פגיעתה עלולה להיות קטלנית. תופעות המחלה מאופיינות על ידי דימומים נרחבים בריריות הפה, האף והעיניים והן מלוות בבצקת, נפיחויות ובצקות ברגליים מעל הטלפיים. הנגיף מועבר על ידי יבחושים עלול לגרום בעדרי בקר למגיפות נרחבות בהיקפן כפי שאירע בישראל ב – 2006

וכפי שקורה בארה"ב באיילים, ובמספר מקרים גם בבקר, דיווחי 2007.

 

מטרות המחקר:

תכנית המחקר הנוכחית מטרתה הייתה להרחיב את הידע וההבנה של הגורם האטיולוגי למחלת ה- EHD, אפיון תהליכי ההדבקה של הנגיף בתאים אנימליים, אפיון מולקולרי של הנגיף, ריצוף הנגיף והכנה של וקטורי ביטוי לחלבוני הנגיף תוך למוד תפקידם. כמו כן למוד התהליך הציטופתי המושרה על ידי הנגיף מתוך מטרה לזהות את האתרים האחראים לאלימות ולאפקט הציטופתי של נגיף ה- EHDV.

המהלך הבסיסי של ההדבקה הנגיפית מכיל את שלבי הכניסה, השכפול של החומר הגנטי, הרכבת הויריון ויציאה מהתא. נגיפים שונים, הנבדלים בהרכב ובמבנה, על מנת להגדיל את יכולת ההדבקה שלהם פיתחו אסטרטגיות שונות לניצול מקסימלי של המשאבים התאיים, תוך כדי הימנעות ממנגנוניי ההגנה של התא.

היבטים רבים של מהלך האינפקציה הם אחידים בין הסוגים השונים של Reoviridae, שאליהם נמנים ה -Orbivirus כמו ה -Bluetongue  וה EHDV -. ביניהם: הכניסה באנדוציטוזה (3, 5, 6, 11, 12), ביקוע פרוטאוליטי ופלישה אל הציטוזול מהאנדוזום (3), בניית viral factories (2, 7, 16, 17) וגרימת אפקט ציטופתי (10, 13-15). כמו כן, סוגים שונים של Reoviridae משרים במהלך האינפקציה תהליך של אפופטוזיס (10, 13-15). מכלול התכונות הנ"ל קובע את היחודיות של המין הנדבק, את יעילות ההדבקה וההתרבות, ואת מידת הנזק הציטופתי/אפופטוטי; כל האירועים האלו נמצאים במתאם ישיר עם דרגת המחלה, פטוגניות המחלה, ברמת החיה.     

Reverse Genetics- היכולת לבצע מוטגנזה מכוונת הנו כלי רב עוצמה בלימוד נגיפים. לאחרונה פותחו מערכות כאלו ב- ,(8) Orthoreovirus  (9) Rotavirus , ול - (1) Bluetongue .למרות ההתקדמות, הטכנולוגיה הקיימת עדיין אינה מאפשרת לפתח חיסון. כמו כן, שום מערכת ל Reverse Genetics  אינה קיימת עבור EHDV.

הפרויקט הנכחי הינו חלק משיתוף פעולה מתמשך של  המעבדות לוירולוגיה במכון הוטרינרי והמעבדה לביולוגיה של התא באוניברסיטת תל אביב, בניהולו של ד"ר ארליך.

שיטות וחומרים ותאור הניסיונות העקריים

דגימות דם מלא ב- EDTA נשלחו או נאספו ממקרים חשודים בשדה. תאי הדם האדומים רוכזו ושטפו מהסרום ושמשו להזרקה תוך ורידית של עוברי עופות. קרומים ונוזל אלנטואי מביצים בהן הדגימות גרמו לתמותת עוברים  עברו אדפטציה לתרביות תאי וורו ו- BHK.

 הנגיף המבודד יורבה בתרביות לכמות של כ- 2 ליטר מהן יופק נגיף מנוקה אשר ישמש בהמשך לאפיון ושיבוט. שיטת  הניקוי שננקוט הינה מבוססת על sucrose cushion centrifugation. מטרתנו הינה  להפיק dsRNA נגיפי (על ידי שימוש בערכות מסחריות) שישמש לprimer ligation. אנו נערוך במקביל שני שיבוטים אשר ישמשו למטרות שונות במחקר הנכחי:

            - שיבוט של הרצף המקודד לחלבונים הנגיפיים השונים אל תוך וקטורי ביטוי המתאימים לתאי יונקים (מכילים promoter מתאים, כגון PCMV). מהלך זה יאפשר ביטוי של החלבונים השונים, בנפרד מתהליך ההדבקה, וזיהוי מאפיינים מולקולרים הקובעים את תפקודם. במסגרת גישה זו, נייצר חלבוני איחוי עם חלבונים פלואורסנטים דמויי GFP (green fluorescent protein), המאפשרים זיהוי ומעקב בתאים חיים.

            - שיבוט עותקי cDNA של המקטעים הגנומיים השלמים של EHDV-7 אל תוך הפלסמידים אשר יהוו בסיס למערכת הReverse Genetics.עותקי הcDNA האלו גם יהוו בסיס קביעת הרצף של הנגיף (הריצוף יתבצע ביחידת הריצוף של הפקולטה למדעי החיים באוניברסיטת תל אביב).   

2.1.5 אפיון מהלך ההדבקה, השריית אפופטוזיס, וגרימת מוות תאית של BTV-16, EHDV2-Ibaraki, וEHDV7.

בתקופה המדווחת התרכזנו בבניית מערכות הניסויים שעליהן יתבסס המשך המחקר. לצורך כך, בשלב ראשון, השתמשנו ב - BTV-16 וב EHDV-2/Ibaraki הדומים מבנית ל - EHDV-7. בנוסף, התחלנו לאפיין את מהלך ההדבקה של נגיף זה בהתבסס על חלבון הNS3 - של EHDV7 המוכר על ידי נוגדים פוליקלונלים אשר פותחו במהלך המחקר.

באופן ייחודי, במהלך המחקר הנוכחי  פותחו:

-          מערכת לזיהוי וכימות ההדבקה המבוססת על RT-PCR (ראה תמונה מס. 1).

-          טכניקות של מיקרוסקופיה בתאים חיים המאפשרות זיהוי ומעקב לאחר האפקטים הציטופטיים (ראה תמונה מס. 2).

-          ניסוים המזהים בטכניקות שונות את התהליך האפופטוטי.

-          נוגדנים מונו-ופוליקלונלים המכוונים כנגד החלבון NS-3 של נגיף הEHDV-2/Ibaraki (ראה תמונה מס. 4) המכירים את חלבון ה - NS3 של הבידוד הישראלי של EHDV7 (ראה תמונה מס. 6) .

-          חלבוני איחוי (ירוקים המבוססים על GFP , ואדומים המבוססים על RFP ) שמאפשרים הסתכלות מולקולרית בזמן אמת על מרכיבים שונים במהלך ההדבקה (ראה תמונות מס. 4, ו - 8).

 

תוצאות

בין המטרות הראשונות של המחקר הנוכחי היה פיתוח היכולת לזהות תאים ותרביות מודבקים, בעזרת שיטות  המאפשרות כימות דרגת ההדבקה. על מנת לכמת את דרגת ההדבקה נקטנו בשתי גישות בלתי תלויות:

1-      זיהוי החומר הגנטי של הנגיף בשיטת semi quantiative reverse transcriptase polymerase chain reaction (sq-RT-PCR). על מנת לבצע את ה sq-RT-PCR  נבחר הגן הנגיפי NS3 הנמצא על גבי המקטע הגנומי S10 וסונתזו כנגדו פרימרים ספציפים: 5’-AAAAGAGATCGGTACCATGC-3’ -TCTTTATCTGTCGCAACCG-3’ 5'- (הנותנים תוצר של כ - (300 bp . הRNA-  של התרבית הופק בפרקי זמן שונים במהלך ההדבקה של תאי כליית טלה (MDOK), בוצעה ריאקצית הsq-RT-PCR- , תוצרי הריאקציה הופרדו בג'ל אגרוז של 1% , וזהינו את תוצרי הDNA בעזרת Ethidium Bromide (תמונה 2, פנל עליון). מהתוצאות שהתקבלו ניתן לראות שב - 12 שעות לאחר תחילת ההדבקה רמת הRNA הויראלי מתייצבת  עד שלבי התמותה (המתרחשים כ-36 שעות לאחר מכן). 

2-      זיהוי וכימות דרגת ההדבקה בעזרת נוגדנים המכוונים כנגד חלבון ה NS3 -. לצורך בדיקה זו יצרנו נוגדנים (פוליקלונלים בעכבר, מונוקלונלים בעכבר ופוליקלונלים בארנבת) המכוונים כנגד הרצף:

n'- C D E M S L V P Y Q E N V R P P S – c'   שהנו שמור בכל נגיפי הEHDV -.  בעזרת נוגדנים אלו זיהינו את חלבון ה - NS3 (בשיטות הImmunoblotting ו - Immunofluorescence). תוצאות ראשוניות של אותם הניסוים ניתן לראות בתמונות 5 ו - 6.

3-   על מנת לחקור את התכונות המולקולריות של החלבונים הנגיפיים של EHDV ללא תלות בתהליך ההדבקה, ועל מנת לעקוב, בתאים חיים, אחר המיקום של אותם החלבונים במהלך תהליך ההדבקה יצרנו חלבוני איחוי (עם החלבונים הפלואורוצנטים GFP ,Green Fluorescent Protein , וCherry RFP- , Red Fluorescent Protein). הסתכלות על תאים טרנספקטנטים לאותם החלבונים נעשתה באמצעות Spinning Disk Confocal Microscope. התוצאות מהסתכלות זו מוצגות בתמונה 3  (לגבי החלבונים NS2 וNS3-) ובתמונה 8   לגבי החלבון VP7. בתמונה 3, ניתן לראות כי בדומה למתואר לגבי מיקומם של אותם החלבונים ב -  Blutongue,

-          NS2-GFP מתמקם במבנים תוך תאיים המזכירים   Viral Inclusion Bodies(הנחשבים לViral (factories.

-          NS3-GFP מתמקם על ממברנות פנימיות של התא (במבנה המזכיר את הEndoplasmic- Reticulum).

על פי הדעה הרווחת בתחום המחקר של ה- Orbiviruses, קיים מתאם ישיר בין התהליך הגורם למוות של התאים המודבקים לביו המחלה הסיסטמית הנגרמת בחיה. עובדה זו מעניקה חשיבות יתרה לפענוח המנגנון הנגיפי הממית את התאים המודבקים (גם בתנאי תרבית). היפותזת העבודה שלנו הייתה שהתמותה הנגרמת על ידי הדבקה עם EHDV הנה אפופטוטית (Apoptotic).  על מנת לבחון את ההיפותזה הנ"ל בצענו שני סוגים של ניסוים בלתי תלויים:

1-  בדקנו את שלמות ה-DNA התאי בשלבים שונים במהלך ההדבקה בעזרת DNA laddering, והנה הסתבר כי זו תופעה המאפיינת תאים  אפופטוטיים. כפי שניתן לראות בתמונה 1 (פנל תחתון).

2- עקבנו אחר השינוים המורפולוגים הנלווים לתהליך התמותה של התאים המודבקים באמצעות Live cell phase contrast microscopy.  לצורך כך, תאי  Vero(תאי כליה של קוף ירוק), הגדלים בבקבוקי תרבית של 25 cm2, צולמו באופן רציף משך 24   שעות, החל מ - 24 שעות לאחר תחילת ההדבקה. בתמונה 2 מוצגים תאים ייצוגיים המראים בבירור את תופעת ה - membrane blebbing. תופעה ייחודית זו הינה מאפיין מרכזי של תהליך אפופטוטי.

מתוצאות הניסויים שבוצעו במסגרת המחקר ניתן להסיק כי - EHDV-Ibaraki גורם למוות אפופטוטי.

 המשך המחקר יתרכז בפענוח מנגנון ההשריה של התהליך ובהשוואה לתהליך דומה המושרה על ידי הבידוד הישראלי של EHDV 7 (תמונה מס. 6).

 

תמונה 1- plaque purification של הבידוד הישראלי של EHDV7. תאי BHK (Baby Hamster Kidney) הודבקו עם נגיפים מהעברה שנייה (2nd passage). 48 שעות לאחר ההדבקה התאים צולמו ב - Phase contrast microscopy . פלאקים , כדוגמת הפלאק המופיע בתמונה, משמשים כבסיס ל - plaque purification. נגיפים אשר יבודדו בצורה זו ישמשו כבסיס למחקר ההשוואתי עם EHDV2-Ibaraki ועם BTV-16

 

תמונה 2- דינמיקה  של הדבקה ושל האינדוקציה לאפופטוזיס

תאי כליית טלה (MDOK) הודבקו עם הנגיף EHDV-2/Ibaraki (MOI 0.7) . בזמנים המצוינים בתמונה. התאים עובדו לצורך RT-PCR על מנת לזהות ולכמת את הRNA  הנגיפי, או לצורך בידוד הDNA שלהם על מנת לבדוק את החיתוך האופייני המלווה את התהליך האפופטוטי (DNA laddering) . נראה שעל אף העובדה שרוב תהליך ההתרבות הסתיים כבר לאחר 12 שעות האינדוקציה לאפופטוזיסלאפופטוזיס הינה מאוחרת יותר

 

תמונה 3 – המוות התאי המושרה על ידי EHDV-2/Ibaraki כולל cell retraction ו - cell blebbing, תכונות אופייניות לתאים אפופטוטים. תאי  Vero (תאי כליה של African Green Monkey) הודבקו עם EHDV-2/Ibaraki וצולמו באופן רציף משך 36 שעות בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופ

 

תמונה 4 – יצירה וביטוי של חלבוני איחוי עם GFP של החלבונים הבלתי מבניים NS2  וNS3 של הנגיף .EHDV-2/Ibaraki הרצפים המקודדים לחלבונים הלא מבניים NS2 וNS3 -  של נגיף ה - EHDV-2/Ibaraki שובטו אל תוך פלסמיד המאפשר ביטוי בתאי יונקים והמקודד לחלבון הפלואורסנטי GFP. NS2-GFP ו NS3-GFP בוטאו בתאי Cos7 וצולמו בעזרת מיקרוסקופ קונפוקלי. שים לב לפיזור השונה של שני החלבונים: NS2-GFP הינו דיפוזי בציטוזול או מתרכז במבנים המהווים Viral factories. NS3-GFP מתמקם על הממברנות של מערכת ההפרשה (Endoplasmic Reticulum  - Golgi Apparatus)

 

 

 

 

 

        

 

תמונה 6 הדבקה עם הבידוד הישראלי של EHDV7 מראה מאפיינים משותפים להדבקה עם EHDV2-Ibaraki. תאי MDOK הודבקו עם נגיף EHDV7 semi-purified ל - 36 שעות. התאים המודבקים עברו fixation and permeabilization ונצבעו עם DAPI ועם נוגדנים כנגד Clathrin (אדום) וכנגד NS3 (ירוק). בדומה לתאים מודבקים עם EHDV2-Ibaraki, NS3 מתרכז בממבראנת התא בשלבים מתקדמים של ההדבקה. כמוכן התאים מראים מספר מאפיינים אפופטותים: cell rounding, nuclear deformation,

ו - Golgi disassembly.

 

 

תמונה 7 נוגדן פוליקלונלי הנוצר בעכבר מזהה את החלבון NS2 בטראנספקציה והדבקה. תאי Cos7 עברו טראנספקציה עם  (A) NS2-GFP או הדבקה עם EHDV2-Ibaraki (B). התאים עברו תהליך של קיבוע , חירור והדגרה עם נוגדנים פוליקלונלים שנוצרו כנגד הרצף EGNRRNLRKRQRNQKKC. רצף זה הנו יחודי לנגיפי ה - EHDV. שים לב לדגם הצביעה (B) המראה את הווצרותם של "viral factories". כמו כן, שים לב לכך שבטראנספקציה עם NS2-GFP מתקבלים מבנים דומים

 

 

תמונה 8  החלבון VP7 של EHDV2-Ibaraki גורם להפרעה בחלוקת התאים המביא ליצירת תאים רב-גרעיניים, בדומה לתופעה המתקבלת בעת ההדבקה עם BTV-16. תאי MDOK עברו טראנספקציה עם VP7-Cherry או  GFP-VP7 או הדבקה עם BTV-16. 24 שעות לאחר הטראנספקציה או ההדבקה, התאים עברו תהליך של קיבוע , חירור והדגרה עם DAPI (המסמן את הDNA התאי(. שימו לב לגרעינים המעוותים הנוצרים כתוצאה של ההדבקה/טראנספקציה.  תופעה זו, מזכירה את התופעה של mitotic slippage המתרחשת כתוצאה של הפרעות למבנה ולתפקוד של מיקרוטובולי בעת חלוקת התא (4). לעיתים תאים העוברים mitotic slippage מבצעים apoptosis; לכן, תוצאה זו מרמזת על VP7 כגורם נוסף לווירולנטיות של Orbiviruses.

 

 

דיון

 

במחקר הנכחי התמקדנו ב: בבידוד הנגיף ממקרים חשודים בשדה. בידודים אלה ונגיף שהתקבל מיפן שמשו בסיס

-          לפיתוח שיטות ניסוייות אשר שמשו כבסיס למחקר ההשוואתי, המשווה בין Orbiviruses שונים, במטרה לזהות את הגורמים לוירולנטיות (virulence) וציטופטיות (cytopathy) של הנגיפים שהנם משותפים לכל הOrbiviruses , או ייחודיים לנגיף מסוים. זיהוי זה, אפשר קביעה של מתאם בין המאפיינים של ההדבקה ברמות שונות: ברמה התאית, ברמה האורגניזם וברמה האפידמיולוגית.

                  פיתוח זה התמקד ב:

-          יכולת זיהוי של RNA  נגיפי- פותח semi quantitative reverse transcriptase PCR assay (sq-RT-PCR) המאפשר כימות של שלב ההתרבות בתהליך ההדבקה. פיתוח השיטה נעשה בעזרת EHDV2-Ibaraki שריצפו ידוע,  ויעבור התאמה לבידוד הישראלי של EHDV7 כאשר נפענח את רצפו.

-          יכולת זיהוי של חלבונים נגיפיים- פיתחנו נוגדנים (mono and polyclonal) כנגד רצף פפטידי שהנו שמור בכל זני הEHDV- . לצורך פיתוח זה, השתמשנו שוב ברצף הידוע של EHDV2-Ibaraki. נוגדנים אלו אכן מכירים את החלבון NS3, מכירים גם את החלבון הנוצר בתאים מודבקים עם EHDV7. עובדה זו מהווה תמיכה נוספת בהנחה שהגורם האטיולוגי של ההתפרצות הישראלית של  ה- EHD 2006 הינו EHDV.

-          יכולת זיהוי ואפיון של התהליכים המושרים על ידי הנגיפים. השערתנו הייתה שבדומה לנגיפים נוספים ממשפחת ה - Reoviridae, גם ה - EHDV בכלל, וגם הבידוד הישראלי של EHDV7 בפרט, גורמים ל  - apoptosis. התהליך האפופטותי, מתרחש ברמה התאית, הנו בעל מתאם ישיר עם מידת הוירולנטיות של Orbiviruses שונים ברמה האורגניזם. לכן, איפיון השוואתי של התהליך האפופטוטי המושרה על ידי נגיפים המראים שוני מובהק ביכולת לגרום למחלה (כגון הEHDV2-Ibaraki והבידוד הישראלי של BTV16)  הנו בעל פוטנציאל להניב הסבר לתופעה זו ויכול לשמש כמעריך באיפיון הוירולנטיות של בידודים חדשים של Orbiviruses.  התוצאות מראות שביכולתנו לזהות ולכמת מספר פרמטרים של התהליך האפופטוטי (DNA laddering, DNA content, membrane blebbing etc.).

-          יכולת לעקוב אחרי חלבונים נגיפיים בתאים חיים. -  פתחנו את היכולת לאיחוי של חלבונים פלואורצנטים עם חלבוני Orbiviruses. יכולת זו פותחה עם חלבונים שמקורם בEHDV2-Ibaraki עקב העובדה שרצפו ידוע, אך היא תורחב לחלבוני EHDV7 עם יוודע הרצף שלהם. היכולת לראות ולעקוב אחר החלבונים הנגיפים בתאים חיים הנה כלי חשוב ובעל פוטנציאל גבוה בקביעת הפרמטרים השונים של המחקר ההשוואתי.

-          זיהוי החלבון VP7 כגורם המשפיע למבנה והתוכן של גרעין התא (תמונה 8).

הגישה הניסוית שננקטה לאורך המחקר נראית מוצדקת ומניבה תוצאות. הערכה זו מתבססת (בין היתר)  על תוצאות (תמונה 6) המראה שבדומה לEHDV2-Ibaraki ובמתאם ישיר עם היכולת ההדבקה של הבידוד הישראלי של     EHDV7  בפרות, מביא למוות אפופטוטי של התאים המודבקים.  

 

References

 

1.         Boyce, M., C. C. Celma, and P. Roy. 2008. Development of reverse genetics systems for bluetongue virus: recovery of infectious virus from synthetic RNA transcripts. J Virol 82:8339-48.

2.         Broering, T. J., J. S. Parker, P. L. Joyce, J. Kim, and M. L. Nibert. 2002. Mammalian reovirus nonstructural protein microNS forms large inclusions and colocalizes with reovirus microtubule-associated protein micro2 in transfected cells. J Virol 76:8285-97.

3.         Chandran, K., and M. L. Nibert. 2003. Animal cell invasion by a large nonenveloped virus: reovirus delivers the goods. Trends Microbiol 11:374-82.

4.         Decordier, I., E. Cundari, and M. Kirsch-Volders. 2008. Survival of aneuploid, micronucleated and/or polyploid cells: Crosstalk between ploidy control and apoptosis. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis 651:30-39.

5.         Ehrlich, M., W. Boll, A. Van Oijen, R. Hariharan, K. Chandran, M. L. Nibert, and T. Kirchhausen. 2004. Endocytosis by random initiation and stabilization of clathrin-coated pits. Cell 118:591-605.

6.         Forzan, M., M. Marsh, and P. Roy. 2007. Bluetongue virus entry into cells. J Virol 81:4819-27.

7.         Kar, A. K., B. Bhattacharya, and P. Roy. 2007. Bluetongue virus RNA binding protein NS2 is a modulator of viral replication and assembly. BMC Mol Biol 8:4.

8.         Kobayashi, T., A. A. Antar, K. W. Boehme, P. Danthi, E. A. Eby, K. M. Guglielmi, G. H. Holm, E. M. Johnson, M. S. Maginnis, S. Naik, W. B. Skelton, J. D. Wetzel, G. J. Wilson, J. D. Chappell, and T. S. Dermody. 2007. A plasmid-based reverse genetics system for animal double-stranded RNA viruses. Cell Host Microbe 1:147-57.

9.         Komoto, S., J. Sasaki, and K. Taniguchi. 2006. Reverse genetics system for introduction of site-specific mutations into the double-stranded RNA genome of infectious rotavirus. Proc Natl Acad Sci U S A 103:4646-51.

10.       Lim, S. I., C. H. Kweon, D. K. Yang, D. S. Tark, and J. H. Kweon. 2005. Apoptosis in Vero cells infected with Akabane, Aino and Chuzan virus. J Vet Sci 6:251-4.

11.       Maginnis, M. S., J. C. Forrest, S. A. Kopecky-Bromberg, S. K. Dickeson, S. A. Santoro, M. M. Zutter, G. R. Nemerow, J. M. Bergelson, and T. S. Dermody. 2006. Beta1 integrin mediates internalization of mammalian reovirus. J Virol 80:2760-70.

12.       Maginnis, M. S., B. A. Mainou, A. Derdowski, E. M. Johnson, R. Zent, and T. S. Dermody. 2008. NPXY motifs in the beta1 integrin cytoplasmic tail are required for functional reovirus entry. J Virol 82:3181-91.

13.       Mortola, E., R. Noad, and P. Roy. 2004. Bluetongue virus outer capsid proteins are sufficient to trigger apoptosis in mammalian cells. J Virol 78:2875-83.

14.       Nagaleekar, V. K., A. K. Tiwari, R. S. Kataria, M. V. Bais, P. V. Ravindra, and S. Kumar. 2007. Bluetongue virus induces apoptosis in cultured mammalian cells by both caspase-dependent extrinsic and intrinsic apoptotic pathways. Arch Virol 152:1751-6.

15.       Owens, R. J., C. Limn, and P. Roy. 2004. Role of an arbovirus nonstructural protein in cellular pathogenesis and virus release. J Virol 78:6649-56.

16.       Parker, J. S., T. J. Broering, J. Kim, D. E. Higgins, and M. L. Nibert. 2002. Reovirus core protein mu2 determines the filamentous morphology of viral inclusion bodies by interacting with and stabilizing microtubules. J Virol 76:4483-96.

17.       Touris-Otero, F., M. Cortez-San Martin, J. Martinez-Costas, and J. Benavente. 2004. Avian reovirus morphogenesis occurs within viral factories and begins with the selective recruitment of sigmaNS and lambdaA to microNS inclusions. J Mol Biol 341:361-74.

18.       Yadin, H., J. Brenner, V. Bumbrov, Z. Oved, Y. Stram, E. Klement, S. Perl, S. Anthony, S. Maan, C. Batten, and P. P. Mertens. 2008. Epizootic haemorrhagic disease virus type 7 infection in cattle in Israel. Vet Rec 162:53-6.

 

לכל המבזקים....
office@milk.org.il פקס: 972-3-9564766 טל: 972-3-9564750 דרך החורש 4 , ת"ד 97, יהוד 5647003
מופעל באמצעות מעוף - מגוון אפקט