אבחון מחלת בת-שחפת בבקר באמצעות שיטות אימונולוגיות והשוואה עם שיטות סטנדרטיות קיימות

קוד זיהוי: 846-0295-05

 

מרסלו שפר1, אורי קורן2, שמאול פרידמן3 , מור פריד3, זינה ביידר1, דניאל אלעד1.
1מחלקה לבקטריולוגיה. המכון הווטרינרי ע"ש קימרון. בת דגן 50250.
2מעצת החלב, ראשון לציון 75054.
3המערך הארצי לבריאות העטין ואיכות החלב, קסריה 38900

 

מבוא ורקע מדעי
מחלת הבת-שחפת נגרמת על ידי החיידק Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP)  המחלה נפוצה בפרות לחלב (Collins, 1994)  . חיידק זה שייך לקבוצת חיידקים הכוללים ביניהם בין היתר גם את גורמי מחלת השחפת והצרעת. התכונה הבולטת של חיידקים אלה (יציבי החומצה) היא מבנה הדופן, המקנה להם כושר עמידות ניכר הן בתנאי סביבה קיצוניים והן כנגד מנגנוני ההגנה של הגוף (Hirsh, 1999) .
חיידקי בת שחפת נחשבים לטפילים מוצלחים ביותר והם מצליחים להתחמק ממנגנוני ההגנה של גוף הפונדקאי , מתרבים בו ללא סימני מחלה, ומופרשים לסביבה, בה כאמור הם שורדים היטב (אך לא מתרבים), ומדביקים חיות נוספות. חוסר התגובה של מערכות ההגנה של הפונדקאי מצד אחד והיעדר הסימנים הקליניים בשלבים מוקדמים מצד שני מונעים את זיהוי החיות המפרישות את החיידק ואת היכולת להרחיקן מהעדר.
טווח הפונדקאים של החיידק רחב וכולל בעיקר מעלי גירה (גדולים וקטנים) – פרות, כבשים, עזים, גמלים, למות, אלפקות, ביזון, אנטילופות ועוד. ישנם דיווחים נדירים על המצאות החיידק גם בחיות אחרות כמו סוסים, חזירים, תרנגולות, ארנבות ואפילו שועלים, אולם הוא אינו גורם מחלה שכיח בחיות אלו.
אחת השאלות המעניינות ביותר לגבי החיידק היא היכולת שלו לחדור לתוך התאים של מערכת החיסון (תאי מאקרופגים), לנטרל את פעולת התאים האלה ולשרוד בתוכם ובעצם ליצור לעצמו סביבה בטוחה בה הוא מסוגל לנצל חומרים בתא לתזונה ולהתחלקות וזאת לאורך זמן.
אפידמיולוגיה: פיזור המחלה הוא כלל עולמי. המחלה שכיחה בעיקר בבקר לחלב וניתן ליחס עובדה זאת לצורות הממשק הנהוגות בענף. גם במעלי גירה קטנים (עדרי צאן) הנגיעות קיימת אך חסרים נתונים שיאפשרו להגיע למסקנות ברורות.
נתוני נגיעות בעדרי חלב כפי שפורסמו ב- 2001 International Dairy Federation Bulletin, 
מראים בניו-זילנד, הולנד, דנמרק אחוזי נגיעות שבין 47-60 % כאשר במדינות ארה"ב , בלגיה, אוסטרליה ואנגליה הנגיעות נעה בין  .   17-22 %
סקר שביצענו על סמך נתונים שנאספו בשירותים הוטרינריים בשנים 1999-2002 מראה כי גם בישראל רוב רפתות החלב נגיעות גבוהה בבת שחפת.
אחוז הנגיעות בתוך הרפתות משתנה גם הוא ונמדד על פי כמות הפרות החיוביות בבדיקה מסוימת מכלל הפרות החולבות בעדר. הנתון הנ"ל מתאים לאופי התנהלות משק החלב בארה"ב בו ישנה תנועה גדולה של בקר בין העדרים ובעיקר בעדרים גדולים או עדרים שנמצאים במגמת גידול, בעוד העדרים הקטנים הם דווקא עדרים סגורים. אופי העדר הישראלי אינו דומה ולכן תיתכן בו תמונה שונה.
שלבים במחלה: ההדבקה היא בעגלות מהמלטה ועד גיל 6 וממשיך בתקופה תת-קלינית, אין סימני מחלה. שלב זה יכול להמשך תקופה ארוכה מאד, לעיתים שנים ואפילו עד סוף חיי הפרה ברפת.
בשלב זה תיתכן יצירה של נוגדנים ועלייה שלהם בסרום. אם מערכת החיסון התאית מצליחה לבודד את החיידק על ידי גראנולומה, זאת אומרת שהפרה לא מראה סימני מחלה אבל ניתן למצוא נוגדנים במחזור הדם בבדיקה סרולוגית. בשלבים האלה ייתכן שהפרה מפרישה את החיידק בצואה או בחלב בכמויות כאלה או אחרות ולפרקי זמן משתנים(Clarke, 1997) .
השלב הקליני: שלב זה הוא השלב בו מזהים בקלות את סימני המחלה – שלשול נוזלי, ירידה בחלב, אובדן משקל מהיר שגורם לרזון קיצוני, בצקות במקומות שונים אך בעיקר מתחת ללסת התחתונה. ביטוי קליני זה בא בעקבות עקה אשר בעקבותיה מערכת החיסון אינה מסוגלת לבודד את החיידק והוא מתפזר בכל הגוף ומופרש עקב כך בכמויות גדולות מאד בצואה ובחלב/קולוסטרום.
נזקי המחלה: נזקי המחלה תלויים בנגיעות העדר ובביטוי הקליני שלה.
על פי עבודה  של  Groenendaal et al. 2002  חלוקת נזקים היא:
 סלקציה שאינה אופטימאלית -  69%
 ירידה בייצור חלב -    22%
 ירידה בערך הטיווחה -   9%

המחקר של  Kudhal et al. 2002  מוסיף שירידת תנובה בפרות תת קליניות (לפי חישוב ב-305 יום בתחלובה ECM) על כל עליה ביחידת OD אחת בבדיקה הסרולוגית היא במבכירות  496 ק"ג חלב שנתית מושווה אנרגיה,  בפרות בתחלובה שניה 1318 ק"ג חלב מושווה אנרגיה בפרות בתחלובה שלישית ומעלה 625 ק"ג חלב מושווה אנרגיה.


אבחון מעבדתי

אבחון המחלה במעבדה חשוב  כי:
 אישוש או שלילה של פרות עם תמונה קלינית וקבלת החלטה מיידית של הוצאות פרות אלה.
 אבחון פרות תת קליניות אשר זו הדרך היחידה לדעת שנדבקו בעבר והיכולת לנקוט אמצעים שיורידו את סיכוני ההדבקה מפרות אלה וימנעו התפרצות קלינית בעתיד.
 קבלת תמונת נגיעות בעדר ובניית תכנית ממשק וסלקציה מקיפה יותר ונכונה בהתאם.
 מניעת מעבר פרות שיכולות לסכן עדרים אחרים.

שיטות האבחון המעבדתי בעולם מבוססות על 1) בידוד וגילוי החיידק גורם המחלה או חלקים ממנו בהפרשות (צואה, חלב, זירמה)  של בע"ח כגון
א. מיקרוסקופית, ב. תרבית ו-ג. מולקולרית  ו-2) השיטות האימונולוגיות שהן
א. גילוי נוגדנים בסרום ו-ב. גילוי תגובה של התאים במערכת החיסון
(Wittington, 2002)

 

מיקרוסקופיה
שיטה זו מבוססת על גילוי ישיר של החיידק ע"י צביעה של  משטח צואה (או חלקי מעי ובלוטות למפה) ולאחר מכן הסתכלות במיקרוסקופ (Hirsh, 1999) . הצביעה היא Zielhl-Nielsen לחיידקים יציבי חומצה. יתרון השיטה היא המחיר הנמוך והחסרונות הן שהטכנאי המבצע חייב להיות מנוסה מאוד וגילוי החיידק תלוי בכמות החיידקים המופרשים בזמן לקיחת הבדיקה. במעבדה משתמשים בה בד"כ למקרים קליניים בהם צפויה הפרשה מסיבית של החיידק או בבדיקת פרות קליניות לאחר שחיטה.

 

תרבית
תרבית חיידקים מחומרים ביולוגים כמו צואה נחשבת ל - GOLD STANDARD  לאבחון בת-שחפת. מדובר בשיטה מסובכת שדורשת קודם כל טיפול מיוחד בצואה על מנת לקטול את כל אוכלוסיית  החיידקים הספרופיטים (צואתיים) ולאחר מכן זריעה בקרקע מזון ספציפי לחיידקי MAP, המכילה חומרים שמאפשרים צמיחת החיידק  ותוספת של חומרים אנטיביוטיים שמונעים צמיחה של חיידקים לא רצויים. תקופת ההדגרה ארוכה ואורכת 45 יום, אם כי לעיתים ניתן לזהות חיידק עוד לפני כן אם התרבית עשירה.
היתרון  היא הסגוליות הגבוהה (Whitlock et al., 2000) שמשמעותה בידוד החיידק החיה נשאית ומפרישה אמיתית. החסרונות הן  שבתקופות שהפרה לא מפרישה חיידקים התרבית תהיה שלילית למרות שייתכן שהיא נגועה. בנוסף,  תהליך הכנת הדוגמאות מסובך ,הדגרה ארוכת זמן ועלותה של הבדיקה יקרה .

 

מולקולרית (PCR)
שיטה זו מאפשרת לזהות חלק של  ה DNA של החיידק שהוא ייחודי לגורם המחלה- MAP.  הגלאי IS 900 מכיר רצף של insertion sequence שנמצא ב MAP כך השיטה בעלת סגוליות גבוה.   קיימות ערכות מסחריות שמסוגלות להפיק ה DNA של החיידק מהצואה (או חומרים ביולוגיים אחרים). ערכות אלו מגלות (לפי היצרן)  חיידקים מהפרשות בריכוז של 100 חיידקים לגרם צואה. פרה חולה יכולה להפריש 100 מיליון חיידקים לגרם צואה, זאת אומרת שהבדיקה מאד רגישה (Whittington,  2002).
יתרון: המהירות שאפשר לקבל באמצעותה תוצאות. ניתן להשלים את הבדיקה ב- 3 ימים (לעומת 45 ימים בתרבית צואה). החיסרון:  המחיר הגבוה.

 

אימונולוגית 
בין השיטות המכונות אימונולוגיות שיטת ה ELISA היא הנפוצה ביותר במעבדות בעולם. עיקרון השיטה: גילוי נוגדנים בסרום או בחלב.
יתרונות השיטה: המחיר הנמוך יחסית והמהירות שאפשר לבצע את הבדיקה.
חסרונות: הרגישות נמוכה ותלויה בגיל הפרה. ככל שעולה גיל הפרה הנבדקת כך עולה רגישות הבדיקה, לכן לא מומלץ לבדוק פרות מתחת גיל 20 חודשים.
קיימת  אפשרות לבצע בדיקת ELISA גם בחלב. בשביל ELISA  בחלב ניתן לקחת דוגמאות בזמן החליבה ולמנוע הצורך בדימום הפרה. 

 

מטרת המחקר
מטרת המחקר להעמיד שיטת אבחון בת שחפת בדוגמאות חלב ולהשוות עם השיטות  המקובלת שנעשות היום בנסיובים.


חומרים ושיטות
חיות הניסוי
המחקר בשנה ראשונה התבסס על דיגום של דם וחלב של735   פרות ב 4 משקים, כאשר בשלב שני נלקח דם מ 987 פרות ב 5 משקים ודוגמאות חלב נלקחו ע"י הדוגם עבור בקורת חלב לאחר תוספת חומר משמר. חלב ביקורת נלקח פעם בחודש מרוב הפרות חולבות בארץ במטרה למדוד מרכיבים כגון חלבון, שומן, לקטוזה ותאים סומטיים.

ערכות ELISA
במטרה להשוות בין אליזה בדם ובחלב נרכשו:
א. ערכות אליזה לבדיקות נסיובים מחברת IDEXX , ערכה זאת בשימוש במכון הווטרינרי לפעילויות שונות, כגון בדיקות קניה-מכירה, איחוד רפתות, מועדון עדרים נקיים, בדיקות של פרות קליניות.  
ב. ערכה אליזה לבדיקות חלב מחברת  SVANOVA  , ערכה  שוודית המאפשרת לבדוק דוגמאות דם וחלב. בערכה זו יש צורך לסרכז דוגמאות חלב לפני השימוש עפ"י הפרוטוקול. נשלח ע"י החברה SVANOVA אישור לשימוש ללא סירכוז.  
ג. ערכות אליזה לבדיקות חלב מחברת Pourquier  , ערכה מחברה צרפתית המאפשרת לבדוק דוגמאות דם וחלב. יתרון של הערכה זו : אין צורך לסרכוז החלבים לפני הבדיקה.
תוצאה חיובית או שלילית נקבעות בהתאם להנחיות היצרן.  
מבחן סטטיסטי
תוצאות הבדיקות והשוואה והתמה בניהן נבדקו במבחן KAPPA .

 

תוצאות ודיון
הערכה מחברת SVANOVA לחלב נתנה אי התאמה מוחלטת עם הערכה של נסיובים הן בחלב פרה הן בחלב בקורת ותוצאותיה בעקבות זאת לא מופיעות בניתוח.
טבלה מס' 1 מראה השוואה בין דוגמאות חלב פרה לנסיובים .מתוך 735 פרות שנבדקו, 39 פרות היו חיוביות ו 684 פרות שליליות עם שני הערכות. 11 פרות היו חיוביות רק בערכת הנסיובים ו 1 חיובית עם ערכת החלב. למבחן Kappa היתה קורלציה של 0.83 שהינה מצוין.
הבדיקה ההשוואתית בין חלב בקורת לנסיובים שנעשתה עם אותם ערכות מראה שמתוך 923 פרות, 43 היו חיוביות ו 859 שליליות עם שני הערכות. 6 פרות היו חיוביות רק בנסיובים ו 15 רק בחלב. ה Kappa  בהשוואה זו הוא 0.80 שהינו טוב מאוד ועל סף המצוין.
עד שנה 2005 נבדקו כ 25.000 פרות לשנה לבת-שחפת בערכה ELISA בנסיובים. בבדיקה בנסיובים, נוצרו בעיות לוגיסטיות בקשר לדיגום דמים ברפתות ובטיפול של הדוגמאות לאחר מכן. התאחדות מגדלי בקר והספר העדר בודקים פעם בחודש דרך החלב כ 85% של העדר ישראלי. החלב של כל פרה מגיע למעבדה מרכזית של ביקורת חלב בקסריה.  
עבודה זו מראה שבדיקת בת-שחפת בחלב פרה או חלב ביקורת יש התאמה סטטיסטית משמעותית בהשוואה לבדיקה סרולוגית בנסיובים, שהיא הבדיקה המקובלת בתוכניות ביעור גדולות. יחד עם זאת, עבודה עם חלב בקורת מקלה על עומס בדיגום דם הן בכוח אדם הן בעלויות. בנוסף, אפשרות לבדק חלב מיכל של כל רפת גם נשקלת במטרה להשוות עם תוצאות פרטניות.

 

טבלה 1. השוואה בין חלב לנסיובים בבדיקת בת-שחפת


Milk sample results
Serum sample results Positive Negative Total
Positive 39 11 50
Negative 1 684 685
Total 40 695 735

Kappa: 0.83


טבלה 2. השוואה בין חלב בקורת לנסיובים בבדיקת בת-שחפת


Milk with bronopol sample results
Serum sample results Positive Negative Total
Positive 43 6 49
Negative 15 859 874
Total 58 865 923

Kappa: 0.80

 

לצפייה בדף התקציר באנגלית >>

ביבליוגרפיה

- Clarke, C.J. (1997). The pathology and pathogenesis of paratuberculosis in ruminants and other species. J. Comp. Pathol. 116:217-261.

- Collins, M.T. (1994) Clinical approach to control of bovine paratuberculosis. JAVMA 204:208-210.
- Groenendaal, H., Jalvingh, A.W., Niele, M., and Horst, H.S (2000). A simulation model to study the epidemiological and economic consequences of johne’s disease control programs. In: Proceedings of the 9th Symposium of the International Society for Veterinary Epidemiology and Economics, pp 590-592. Breckenridge, Colorado. 
- Hermon_Taylor, J. (2002) Mycobacterium avium subsp. Paratuberculosis and its relation to Crohn’s disease. Proceedings of the Seventh International Colloquium on Paratuberculosis. Pp:299. Bilbao. Spain.
- Hirsh, D.C. (1999). Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis. In: Veterinary Microbiology. Ed: Hirsh, D.C. and Zee, Y.C. Pp: 463.
- I.D.F. (2001). International Dairy Federation Bulletin, 362.
- Kudahl, A., Nielsen, S.S and Tsorensen, J.T. (2002). Effects of paratuberculosis on lactation curves of Danish Cows. Proceedings of the Seventh International Colloquium on Paratuberculosis. Pp:513. Bilbao. Spain.
- Whitlock, R.H., Wells, S.J., Sweeney, R.W., and van Tiem, J. (2000). ELISA and fecal culture for paratuberculosis (Johne’s disease): sensitivity and specificity of each method. Veterinary Microbiology 77:387-398.
- Whittington,R. (2002) An overview of paratuberculosis diagnostic tests. Proceedings of the Seventh International Colloquium on Paratuberculosis. Pp:131-135. Bilbao.  Spain.

לכל המבזקים....
office@milk.org.il פקס: 972-3-9564766 טל: 972-3-9564750 דרך החורש 4 , ת"ד 97, יהוד 5647003
מופעל באמצעות מעוף - מגוון אפקט