תכנית מספר 845-0263-09

 

ישום שיטת Fluorescence Polarization Assay (FPA) בניטור בקר לחלב למחלת הברוצלוזיס

 

חוקרת ראשית: ד"ר סבטלנה ברדנשטיין, המעבדה לבקטריולוגיה, מכון וטרינרי ע"ש קמרון, בית דגן 50250, ישראל

חוקר משנה: ד"ר מנחם בנאי, המעבדה לבקטריולוגיה, מכון וטרינרי ע"ש קמרון, בית דגן 50250, ישראל

 

 

תקציר מדעי

מחלת ברוצלה מליטנזיס בצאן גרמה בעבר לחדירתה לבקר לחלב. בדיעבד נמצא כי אבחון המחלה בפרות היה בד"כ מאוחר לעומת זמן ההדבקה.  בדקנו התכנות של השימוש בשיטת ה – FPA לבדיקות מהירות ואמינות לאבחון נוגדנים לברוצלה בבקר לחלב ובצאן בישראל. בנוסף, בדקנו יישום השיטה למטרת ניטור משקי הבקר לחלב בישראל כנגד מחלת הברוצלוזיס באמצעות מבחן FPA בחלב. עבודתנו זו, ואבחון שגרתי של ברוצלוזיס במעבדה הראו שלמרות התאמה כללית טובה בין השיטות הסרולוגיות שנוסו, וללא קשר לסוג המבחן, המחלה בראשית ההדבקה ברפת (או בדיר) הינה נסתרת היות והנוגדנים מתפתחים רק לאחר ההמלטה (או ההפלה). מאמרים שפורסמו הוכיחו כי חיידקי הברוצלה (אבורטוס וגם מליטנזיס) משתמשים במנגנון חדירה נסתר  (Stealth infection)למערכת החיסון הטבעי של המאכסן

ותוצאה זו מתאימה לממצאנו. לאור זאת, נדרש שהשו"ט ישקלו שינוי מדיניות מעקב ושליטה במחלה על ידי מתן הדגש לבדיקות הצאן והבקר בסוף תקופת ההריון ועד לאחר ההמלטה. בנוסף, תוצאות המבחן בשיטת ה- FPA לעומת בדיקת המשלים (CFT) הראו כי שיטת ה – FPA מראה לעיתים נוגדנים לחיסון (בבקר ובצאן) ללא קשר לנוכחות המחלה.  המבחן מתאים על כן לשמש כשיטה לגיבוי המערכת לצורך בדיקות מהירות ואמינות. ההוכחה לנוכחות המחלה צריכה להיות באמצעות בידוד ברוצלה מחמרים חשודים ושהמבחן הקובע בתכניות שליטה וביעור יהיה מבחן המשלים.

 

מבוא ותיאור הבעיה

בשנים האחרונות ישנה מגמה של הופעה מחודשת של מחלת הברוצלוזיס בצאן, ועמה סכנה מוחשית לחדירה של המחלה לרפתות לחלב. בשנת 2006, רפת חלב גדולה של רביבים, עם  כ- 800 חולבות, ו 3 רפתות קטנות בישוב פטיש, חלו בברוצלה מליטנזיס ביוואר 1

.(B. melitensis biovar 1) לאור הסכנה הזואונוטית, עם העלאת החשד למחלה, הוטל הסגר על המשק  עד לביעור מוחלט של המחלה. כאשר עולה חשד למחלה, הוכחת המחלה נעשית על ידי בידוד החיידק מהחלב ואברים פנימיים מחד, ומעקב אחרי מהפך סרולוגי, מאידך. מאז הפיכת החשד לעובדה, כתוצאה מבידוד ברוצלה מחיות נגועות, המעבר מחדש לסטטוס משק נקי מהמחלה מותנה בהוכחה של 3 בדיקות סרולוגיות עוקבות, בהפרשים של כחודש וחצי אחת מהשניה, ועם תוצאה שלילית של כל הפרות ברפת. הצורך בבדיקות המוניות ובתדירות גבוהה מחייב שימוש במבחנים סרולוגיים מדויקים הזמינים לאוטומציה. לפיכך, לבד מהחשש לבריאות הציבור מחלת ברוצלה מליטנזיס ברפתות הינה בעלת משמעות כלכלית גבוהה הכוללת הפסדים כבדים בחלב ובשחיטה (או המתה) של כל הפרות שעלה חשד להיותן נגועות. כמובן, ככל שהדיוק באבחון עולה כך יחסכו בדיקות נוספות מחד וישחטו רק פרות חולות, מאידך. במצב כזה, עלות הביעור תקטן. לעומת זאת, ככל שהדיוק באבחון יחסר כך העלויות יגדלו גם בשחיטה של פרות שהוגדרו חולות בטעות וגם בהארכה של משך המחלה במשק בגלל אי הוצאתן של הפרות החולות.

גורמי המחלה הם חיידקים המשויכים לסוג ברוצלה (Genus Brucella). החיידקים הינם גרם שליליים, ואורח החיים הקובע שלהם הינו תוך תאי, בתאים השייכים למערכת הרטיקולו-אנדותליאלית של המאכסן. שלשה מינים (species) חשובים ישנם בתוך הסוג, ברוצלה מליטנזיס, ברוצלה אבורטוס וברוצלה סוויס, ולאלו זיקה לחיות המשק החשובות, הצאן, הבקר והחזירים, בהתאמה. במאכסן, החיידקים הינם גורמי הפלה, בשליש האחרון של ההריון, וזהו עוד נדבך במשקל הכלכלי של נזקי המחלה (Alton et al., 1988). למרות זאת, עיקר הבעיה למשק נובעת מהקשר הזואונוטי של המחלה עם האדם היות ומחלת הברוצלוזיס (קדחת מלטה) היא קדחתית בצורתה הפשוטה אך ללא טיפול מיידי המחלה נשמרת במצב כרוני עם אפשרויות לנוירו-ברוצלוזיס, אוסטיאומיליטיס, הגדלת טחול ו/ או כבד ודלקת אשכים בזכרים, ובמקרים מועטים מוות (Young, 1995; Madkur, 1989). המחלה יכולה להתהוות מיד עם החשיפה לחיידק, אך גם להיות לטנטית באופן שההתפרצות תהיה חדשים ואף שנים לאחר כך

 (Samartino et al., 2006) . בהיות הסימנים הקלינים דומים לאלו של שפעת רגילה, רופא המשפחה יכול להחמיץ האבחון ובכך להחמיץ את המחלה הקלינית. הטיפול מורכב ממתן אנטיביוטיקה משולבת ולאורך זמן, לעיתים ללא הצלחה  (Relapse, recurrence, chronic brucellosis, sub-clinical, local).

כחיידק גרם שלילי, מעטפת החיידק כוללת אנטיגן ליפופוליסכריד (Lipopolysaccharide, LPS) שקבוצת הרב סוכר שלו (O-chain antigen) מהווה מרכיב עיקרי בתגובה ההומורלית. היות והמחלה ידועה מראשית המאה הקודמת, פותחו מבחנים סרולוגיים המיועדים לגילוי נוגדנים של המאכסן כנגד החיידק. השיטות של אגלוטינציה במבחנה (SAT), קביעת משלים (CFT) וורוד בנגל (Rose Bengal) הינן בינלאומיות לאחר שנקבעו על ידי הקהילה הבינלאומית כמבחנים המתאימים לבדיקת ברוצלוזיס הבקר לצורך מסחר בבעלי חיים בין מדינות (OIE, 2008) . בדיקות אלה כוילו וקבלו התווית תקן כאשר קביעת המשלים נבחרה כשיטה מאבחנת קובעת לבדיקה לצורך מסחר בבעלי חיים ובתוצרתם. שלוש השיטות האלה מיושמות במעבדה לברוצלוזיס שבמכון הוטרינרי (Baum, et al., 1995), מעבדה שהוכרה כמרכז ארצי למחלה ואחת משש המעבדות העולמיות המוכרות כמעבדות ייחוס של ה – OIE, הארגון הקובע בניהול מדיניות בריאות בעלי חיים בתוך המדינות ובייחסי המסחר בבעלי חיים בין המדינות החברות בארגון.

בהיות המחלה הרת אסון, מעצם פגיעתה במשק בעלי החיים ובעיקר כתוצאה מהאפשרות לפגיעה בבריאות האדם (Zooonosis) נעשו בראשית המאה הקודמת מאמצים רבים לפיתוח תרכיב להגנה על בעלי החיים.  עד כה אין בנמצא תרכיב להגנה של האדם אך פותחו זנים חיים ממוירים שהוכרו לשימוש בשדה בתנאים מסוימים

.(Elberg and Faunce, 1957; Buck, 1930) בהיותם זהים במבנה האנטיגני לחיידקי השדה האלימים, מתעוררת בעיה של השימוש בתרכיבים האלה, שכן הם מעוררים הווצרות נוגדנים הזהים לנוגדני האבחון ולפיכך אי אפשר להבדיל בשימוש בשיטה הסרולוגית בין חיות חולות לבין חיות שחוסנו. כדי להתגבר על הבעיה, ובתובנה שהחיסון המגן מבוסס על התגובה התאית של מערכת החיסון  (Ko and Splitter, 2003; Oliveira et al., 2002) פותחו גישות שונות של חיסון שמטרתן להפחית את עצמת התגובה ההומורלית לחיסון מחד, ופיתוח שיטות אבחון סרולוגיות מבדילות בין תגובה לחיסון ותגובה למחלה, מאידך. בין השיטות הסרולוגיות מהעת החדשה, מוכרות

competitive ELISA (c-ELISA) and indirect ELISA (i-ELISA), שיטות המאופיינות ברגישות וסגוליות גבוהים במיוחד הקרובים ל 100% (Gall and Nielsen, 2004). במבחן הביצוע המרכב מסך שני מרכיבים אלו ניתן לאמוד שיטות אלו כיעילות במיוחד ומתאימות כמבחן רשום לבדיקת בעלי חיים לצורך יבוא/יצוא על ידי ה – OIE

 

לאחרונה התפתחה שיטת אבחון לגילוי נוגדנים לברוצלה בדם מלא, סרום, וחלב על בסיס שינוי ב  (FP) Fluorescence polarization. השיטה מבוססת על הרעיון שלמולקולות קטנות יש תנועה חופשית בנוזל ולפיכך, אור מקוטב שיעבור דרך מולקולה פלורסנטית קטנה יתפזר ויבטל את מידת הקיטוב. אותה מולקולה פלורסנטית, בהתקשר אליה גוף גדול, תוגבל בחופש הסיבוב שלה, ולפיכך אור מקוטב שיעבור דרכה יישאר עם מידת קיטוב גבוהה. על בסיס זה, אניטגן ה –

 O-  chain של החיידק שאליו מקושרת מולקולת פלורסין בצורה כימית יהיה בעל גודל קטן, ולכן יסתובב בחופשיות בנוזל ויבטל את קיטוב הפלורסנציה. מאידך, אם לאנטיגן יקשר נוגדן, שהינו מולקולה גדולה, מהירות סיבוב המולקולה תקטן וישמר הקיטוב. לפיכך, רמת הקיטוב הנמדדת תשקף את רמת הנוגדנים נגד ברוצלה בסרום הנבדק. כפי שמשתמע מתיאור השיטה, בניגוד לשיטות כמו ELISA, הדורשות רצף של הדגרות ושטיפות על מנת לקבל את התוצאה הסופית, שיטת הפולריזציה הינה "הומוגנית" בעובדה שהקשר נוגדן אנטיגן נבחן במבחנה באופן ישיר. יש בכך כדי למנוע עיוותים של התוצאה שיכולים להתקיים בתהליך השטיפות. בהיות השיטה  רגישה, ובעלת סגוליות גבוהה, מחד, ומהירה וקלה לביצוע באמצעות מכשיר מעבדה אוטומטי, מאידך, יש לשיטה זו יתרונות רבים בייעול העבודה במעבדה לבדיקה המונית בזמן קצר ובאיכות גבוהה ביותר (Gall and Nielsen, 2004).

תוצאות העבודה שלנו כמו גם התוצאות שהתקבלו באבחון בשגרה של המחלה במעבדה הראו כי ללא קשר לשיטה הנבדקת, נוכחות נוגדנים בדוגמה נצפתה רק לאחר השלמת ההמלטה (או ההפלה). ממצא זה שפורסם לאחרונה בכינוס אוהלו באילת, 2009

 (Bardenstein and Banai, 2010)מתאים גם לספרות המוכיחה כי ברוצלה מדביקה את המאכסן בדרך סמויה למערכת החיסון (Stealth infection). לפיכך, מומלץ לשו"ט לשנות את שיטת הניטור וביעור המחלה על ידי מתן קדימות לבדיקות בסוף ההריון או לאחר ההמלטה. לאחרונה, נמצאה רפת חולבת קטנה חיובית במבחן החלב אך הגורם להתפתחות זו היה ברוצלה אבורטוס זן חיסון 19. יישמנו את שיטת ה – FPA באבחון הרפת כהשלמה של תשומות המעבדה להשגת תוצאות אמינות בזמן קצר ובאופן אמין. עודף הרגישות של השיטה לנוכחות נוגדנים לחיסון הביא לאבחון שתי פרות נוספות שלא הוכחה בהן בעיה. תוצאות דומות התקבלו בצאן. לפיכך, השיטה אינה קבילה בעדרים מחוסנים כמבחן הקובע ויש להוכיח את המחלה על בסיס בידוד החיידק ובדיקות סרולוגיות בשיטה הקיימת של CFT.

 

מטרות המחקר

  • הכנסת השיטה לשימוש שוטף במעבדה, והשוואת התוצאות בין סרולוגיה שנעשתה במעבדתנו לתוצאות המתקבלות בשיטת FPA.
  • קביעת מדדים של זמן עבודה הנדרש לאבחן רפת גדולה או עדר צאן גדול, וכן האפשרות לשפוט סטטוס מחלה על בסיס תוצאות הפולריזציה בשימוש בתוצאות קביעת המשלים כמדד לתוצאת אמת.
  • השוואת תוצאות בדיקות דוגמאות חלב במכשיר הנייד (Sentry 100) מול מבחן MRT.
  • השמת השיטה בניטור בקר וצאן כחלק מעבודתנו בשליטה, בבקרה ובביעור של ברוצלוזיס בישראל.

 

חומרים ושיטות

דוגמאות סרום – דם נאסף במבחנות ואקום  עם ג'ל וסרום נאסף לאחר קרישת הדם על ידי הפרדה בצנטריפוגה. דוגמאות נאספו מחיות בריאות, חולות ו-או מחוסנות, כמפורט בדו"ח.

דוגמאות חלב – נלקחו דוגמאות חלב של טנק חלב או מפרות בודדות לפי המדווח כאן.

מבחן קביעת משלים – בוצע במעבדתנו על פי הנוהל הקיים(Baum et al., 1995) . מבחני ELISA i-ELISA, c-ELISA)) בוצעו בקנדה, על פי הספרות (בוצע רק לגבי אבחון רפת רביבים ב 2006, דו"ח שנה ראשונה). מבחן חיובי ב – i-ELISA נמדד כאחוז מהקריאה של סרום ידוע בעל תגובה חיובית גבוהה. מבחן חיובי ב – c-ELISA נקבע כאחוז של דרגת העיכוב של קישור נוגדנים מונוקלונאלים כנגד האנטיגן שבפלטה.  מבחן חיובי ב – FPA נקבע על פי יחידות מיליפולריזציה שהיו גבוהות ב – 20 יחידות מאלו של רמת ה – cutoff הנמדדת עם סרום שלילי

 (Paulo, et al., 2000). בישראל עבדנו עם מכשיר GeniosPro, Teacan שמעבד באופן אוטומטי את הדיגום והקריאה של התוצאה במיקרופלטות, כולל שיפוט בין תוצאה שלילית לחיובית. דוגמאות חלב נבדקו עם מכשיר Sentry 100, Diachemix, המופעל ידנית וקורא מבחנה אחת בכל פעם.

בקטריולוגיה – בידוד ברוצלה נעשה על פלטות Tryptic soy agar מועשרות בסרום-דקסטרוז (Alton et al., 1988). הגדרת הזן שבודד נעשתה על פלטות צבעים ובשימוש בסרום מונוספציפי שהוכן במעבדה.

 

תוצאות

בדו"ח פעילות והישגים של השנה הראשונה תארנו בדיקת התכנות של השימוש ברובוט לבדיקות המוניות מדויקות של דוגמאות סרום מבקר ומצאן על ידי השוואת התוצאות המתקבלות ב – FPA לאלו שמתקבלות במבחן קביעת המשלים. הראינו כי השיטה מהירה לביצוע ומאפשרת בדיקת עדר בן כ – 1000 ראש בשעות ספורות. זאת, על ידי שילוב של רובוט לחילוק דוגמאות הסרום למיקרופלטה מחד, ובדיקת הדוגמאות בשיטת ה – FPA (המנוהלת על ידי מכשיר בודק הפולריזציה באופן עצמאי), מאידך.  מבחן ה – FPA נוסה במאות אחדות של דוגמאות סרום שנלקחו מעגלות לפני חיסון כמו גם לאחריו, וכן מרפתות חשודות למחלה על פי בדיקות שבשגרה. השיטה נמצאה רגישה לנוכחות נוגדנים נגד ברוצלה ברמה הקרובה ל – 100% ולפיכך גם פרות נמצאו מגיבות באופן חיובי למבחן אך התגובה יוחסה לנוגדנים לחיסון. בעגלות לפני חיסון התוצאה היתה שלילית עובדה המלמדת על סגוליות השיטה ברמה של 100%.

המבחנים בצאן כללו דוגמאות סרום שנלקחו מעיזים מעדר חולה על בסיס נתונים של המעבדה, ובהמשך מעדרים פתוחים ששמשו להשלמת המקנה בעדר לאחר הביעור. חלק רב מהבדיקות ייושמו לגבי עדרים בהם נעשתה במקביל בדיקה של החלב לבידוד החיידק. בשנה השניה הרחבנו את הבדיקות גם לעדר כבשים (מהרשות הפלסטינאית) שהיה ממנו בידוד זן חיסון B. melitensis Rev. 1

בבקר ובעיזים (עיזים היו מטרת המחקר) נמצאה התאמה בתוצאות של שתי הבדיקות, אך היו דוגמאות סרום שהגיבו רק באחד המבחנים ולא בשני, או להפך. מספר הדוגמאות החיוביות ב – FPA בלבד היה רב בערך פי שלשה ממספר המגיבות רק בקביעת המשלים (טבלאות  1- 3) מאידך, אם כוללים בחישוב גם דוגמאות שנמצאו חשודות במבחן FPA עולה היחס עד לפי 8. טבלה 3 מסכמת את ההשוואה בין ביצועי השיטות: קביעת משלים (CFT) לעומת ה – FPA בעיזים.

באלו המקרים בהם היתה התאמה בין קביעת המשלים והפלורסנציה בקבוצת המגיבות החיוביות, בין בבקר ובין בצאן, נמצאו ביניהן כאלו המפרישות את החיידק בחלב (טבלאות 4, 6, בהתאמה). מאידך, נמצאו שתי כבשים החיוביות בפלורסנציה שהיו שליליות במבחן המשלים ובכל זאת נמצא בידוד של החיידק בחלב (טבלה 4, זן תרכיב Rev.1). ישנה כמובן אפשרות שמבחן הפלורסנציה רגיש יותר מקביעת המשלים ועל כן מזהה בין המגיבות גם כאלו שהנוגדנים שלהן נוצרו כתוצאה מחיסון ולא ממחלה. יתרון הרגישות הופך לחסרון מכריע בשימוש בשיטה ככלי שיפוט לאיתור חיות נגועות לצורך השמדה, היות ותגובתן יכולה להיות תגובה בריאה לחיסון ובאופן פרדוקסאלי, איתור חיוביות בפלורסנציה גורם לסילוק הבריאות והמחוסנות מהמשק החולה.

טבלה 5 מתארת בדיקה משווה של בקר לחלב בין בדיקת ה – חלבFPA או מבחן הטבעת. הטבלה מראה שמבחן הטבעת הינו רגיש יותר (394 דוגמאות חיוביות מתוכן 54 הניבו ברוצלה) לעומת 249 (כולל חשודים) מקרים עם 34 בידודים. עדיין, ב- 210 דוגמאות נמצא מתאם מלא בין שתי הבדיקות שהניבו 34 בידודים. היו 184 דוגמאות בהן מבחן הטבעת היה חיובי וה – FPA שלילי ומהן היה בידוד ברוצלה ב – 20 דוגמאות ו – 39 דוגמאות (חיובי וחשוד) שהיו שליליות במבחן הטבעת אך ללא בידוד ברוצלה. חשוב לציין, נמצאו 189 דוגמאות שהיו שליליות בשני המבחנים אך מהן היו חמישה בידודים. לפיכך, יש חשיבות למדוד את נוכחות הנוגדנים בחלב כחלק מהניטור של העדר, ומבחן הטבעת עדיף, אך צריך לזכור כי ישנן פרות שמפרישות את החיידק בחלב ללא סימן נוגדן באף אחת מהשיטות. תוצאה אחרונה זו הוראתה גם לגבי הבדיקה הסרולוגית של הנוגדנים בדם במבחן המשלים וב- FPA, בהתאמה (דו"ח שנה ראשונה).

 

ניתוח סטטיסטי – "מבחן חי בריבוע" בודק התאמה בין תוצאות שהתקבלו בשתי מערכות בדיקה שונות. בדקנו את הנתונים שהתקבלו במבחן זה והראנו התאמה יפה בין שיטת הפלורסצנציה לבין קביעת המשלים. למרות זאת, איננו מביאים את הבחינה הסטטיסטית בדו"ח המסכם, היות והתברר כי נמצאה הטיה של המבחן כתוצאה משימוש בנתונים שנאספו באופן רטרוספקטיבי ומרבית הבדיקות נתנו תוצאה שלילית בשני המבחנים לעומת תוצאות חיוביות שהתקבלו במספר מצומצם בלבד. זאת, בניגוד לניסוי מתוכנן בו נקבע מראש מספר הדוגמאות שצריכות להבחן.  יש לציין כי בדיקת הפלורסצנציה וגם שיטת קביעת המשלים עברו אימות בין-לאומי כבר קודם לעבודתנו ולכן לא היה צורך עניני בבדיקה הסטטיסטית.

 

דיון

שיטת הפלורסנציה (fluorescence polarization assay – FPA) מבוססת על בדיקת התגובה בין אנטיגן לנוגדן ביחידות פולריזציה בבאר הבדיקה וללא שטיפות (בדיקה הומוגנית), מחד, ושיפוט התוצאה לפי עצמת הפולריזציה בין שלילי, חשוד וחיובי, מאידך. השיטה לפיכך מהירה ומאפשרת בדיקות המוניות של עד כ – 1000 דוגמאות ביום אחד של עבודה. זאת לעומת בדיקת קביעת המשלים המחייבת מיומנות ושליטה בטכניקה, בד בבד עם חלוקת העבודה לשני שלבים המבוצעים ביומיים עד לקבלת התוצאה (ביום ראשון הדגרה של תערובת המכילה את המשלים, סרום ואנטיגן בבאר הפלטה, וביום השני מבחן ליזיס של תאי דם מרוגשים למשלים לפי כמותו שנותרה במערכת התגובה לאחר ההדגרה ביום הראשון). קריאת התוצאה נעשית בעין והינה גורם מגביל שלישי לעומת הפלורסנציה.

הופעת המחלה נמצאה בחלק נכבד מהמקרים, בין בצאן או בבקר, כהפרשה של ברוצלה בחלב קודם למהפך הסרולוגי של הסרום (Bardenstein and Banai, 2010). עובדה זו מציינת את הבעייתיות בניטור עדרים על בסיס סרולוגיה בלבד שכן הפרשת הברוצלה בחלב אינה מאותרת במבחן הסרולוגי בעוד שהחיה מהוה סכנה לעדר ולסביבה בהיותה מפרישה של חיידקי ברוצלה.

ניתן לסכם שהתוצאות שהתקבלו במבחנים הסרולוגים ההמוניים (גם בבקר לחלב וגם בצאן) תומכות בעובדה שמבחן ה – FPA הינו מהיר במיוחד, מבלי אבוד הסגוליות הגבוהה. עובדה זו מאפשרת שימוש במבחן ה – FPA בבדיקות לסריקה של עדרי בקר לחלב בעת התעוררות חשד להתפרצות ברוצלוזיס. 

ארוע שהיה לאחרונה בעדר בקר לחלב מדגים את הלקחים שנלמדו (טבלה 6). בבדיקות שגרתיות של טנק חלב נמצאה תגובה חיובית במבחן הטבעת. לאור תוצאה זו נלקחו דגימות חלב מכל הפרות החולבות ובו זמנית הן נדגמו לסרולוגיה. פרה אחת (648) נמצאה חיובית במבחן הטבעת והיה בידוד חיידקי ברוצלה מן החלב (ארבעה ימים מאוחר יותר). לאחר הגדרת הזן, התברר כי החיידק שבודד היה ברוצלה אבורטוס זן תרכיב 19. לא היה בידוד נוסף מאף אחת מיתר דוגמאות החלב. במבחן הסרולוגי נמצאה פרה 648 חיובית במבחן קביעת משלים (CFT) ואילו יתר הפרות היו שליליות. לעומת זאת, במבחן סרולוגי FPA נמצאו בנוסף לפרה 648 עוד שתי פרות חיוביות שהיו שליליות במבחן קביעת משלים ולא נמצא בידוד ברוצלה בדוגמת החלב. כפי שנראה בטבלה המלווה, כל שלש הפרות חוסנו כעגלות בנות 3 – 4 חודשים. פרה 647 חוסנה בו ביום עם פרה 648 ואילו פרה 630 חוסנה כמה חודשים קודם. ניתן לכן לחשוד בזן 19 כגורם משותף לתגובות שנמצאו ב – FPA.


 

 

המלצות

מבחן ה – FPA הינו רגיש ובעל סגוליות בדרגה הקרובה ל 100%. לכאורה, יש עדיפות למבחן ה – FPA לעומת קביעת המשליםCFT) ). מאידך, מבחן ה – FPA מגלה גם נוגדנים שנוצרו כתגובה לחיסון ובכך יוצר מיסוך בעת אבחון המחלה. מומלץ על כן להשתמש במבחן ה – FPA כשיטה תומכת לניטור עדרי בקר לחלב ו/או עדרי צאן וכן לבחינת היקף חדירת מחלה לעדר שנמצא חשוד. מומלץ לקבל תוצאות ראשוניות במבחן ה – FPA שלאורן ניתן יהיה להעריך בזמן קצר את עצמת חדירת המחלה למשק ולנקוט באמצעים מונעים ראשוניים להכלה של הארוע באופן יעיל. בגלל האפשרות לתגובה של חלק מהחיות הנבדקות לחיסון, יש לחזור ולבדוק את העדר במבחן קביעת המשלים, שהינו המבחן הסרולוגי הקובע לזיהוי פרות חולות "אמיתיות" (תמונה 1).

מבחן ה FPA של החלב נתגלה כפחות רגיש לעומת מבחן הטבעת בזיהוי נוגדנים לברוצלוזיס בחלב. מאידך, לפחות ב – 5 דוגמאות חלב שנלקחו מפרות ממשק נגוע נתקבל בידוד זן ברוצלה מדוגמאות שהיו שליליות  בו זמנית במבחן הטבעת ומבחן ה – FPA חלב. לפיכך, למרות חוסר הרגישות ביחס למבחן טבעת ניתן להשתמש במבחן ה – FPA כשיטה תומכת, בנוסף למבחן הטבעת, בכדי להגדיל את רגישות האבחון של מחלת הברוצלוזיס בזמן ניטור עדרי חלב לבקר.

 

הבנת הפתוגניות של המחלה וההשלכות לגבי ניטור ברוצלוזיס בבקר לחלב ובצאן

לאור הממצאים שנאספו במחקר זה וביחד עם ממצאים אחרים שהתקבלו במהלך עבודת המעבדה בשדה ברור היום כי הפתוגנזה של מחלת הברוצלוזיס מורכבת יותר ממה ששוער עד כה. התברר לנו כי חיידקי הברוצלה חודרים לגוף באופן שקט שאינו נראה למערכת החיסון וללא ייצור נוגדנים במאכסן בזמן התיישבות הברוצלה בגוף. החיידקים שורדים ומתרבים בתאים הבלעניים המקצועיים (מאקרופאגים) ונשארים באופן כרוני בגוף המאכסן בתוך התאים הבלעניים. עם התפתחות ההריון, תאים טרופובלסטים שבשליה בולעים את הברוצלה ונוצר תאום בין חיידקי הברוצלה והטרופובלסטים. בתחילת ההריון ברוצלה שורדים בטרופובלסטים. אנו משערים שבסוף ההריון יש לחיידקי הברוצלה מנגנון ביולוגי שמשחרר אותם מה"בועה" שבה שרדו בתא הטרופובלסט ואז, מתוך שברחם הבוגרת יש אריתריתול זמין כמקור פחמן ואנרגיה, הם מתרבים בתא וגורמים למוות מתוכנן (אפופטוזיס של התא) ופלצנטיטיס. זה האחרון גורם להפלה והפרשה של חיידקי הברוצלה לסביבה ולהיותם גורם הדבקה אופקי ברפת או בדיר (Bardenstein and Banai, 2010).

נראה שחיידקי הברוצלה משתתפים באופן ביולוגי בתכנון הקיום שלהם בטבע על ידי תזמון (סינכרוניזציה) של ההתרבות והפיזור שלהם בסביבה עם ההריון המתפתח של המאכסן. לכן, בדיקות סרולוגיות לפני תום ההריון, או ההפלה, יתנו תוצאה שלילית כוזבת

 (False negative) ללא קשר עם שיטת הבדיקה (Bardenstein and Banai, 2010). לכך יש השלכות לגבי תכנון שליטה וביעור של המחלה. השו"ט חייבים להתאים את זמן הבדיקות לסוף ההריון (או ההפלה) כאשר הפרה חולבת. אין טעם להשקיע זמן ומשאבים לבדיקת ברוצלוזיס בעגלות בהריון. לעומת זאת, מבכירות חולבות צריכות להבדק סרולוגית בהקשר למועד ההמלטה, החל מהחודש השני להריון ומעלה. החלב צריך להבדק באותם מועדים ובדרך כלל, מבחן הטבעת יהיה יותר יעיל לאבחון המחלה משיטת ה – FPA. ניטור החלב לנוכחות החיידק צריך ללוות תהליך ביעור של רפת שהוכחה כחולה, והמאמץ הבקטריולוגי צריך להתקיים ללא קשר אם הסרולוגיה (של הסרום או בדיקת החלב) נתנה תוצאות שליליות.

הנחת העבודה שלנו היא כי בעקבות השינוי בהבנת המחלה, ניתן לשפר גם את ביעור המחלה בצאן. בכדי להשיג זאת,  השו"ט צריכים להתאים מדיניות ברוצלוזיס אחידה בכל הנוגע לחיסון, רישום ובקרת תנועה של הצאן, ושחיטה של החיות הנגועות. באופן מיוחד, יש צורך לפתח שיטה מהירה ואמינה לאימות בקטריולוגי של מציאות החיידק בדוגמה בזמן אמת. השיטה גם צריכה להיות זולה בכדי לאפשר בדיקות חוזרות בתדירות גבוהה היות ושיטת הבידוד הבקטריולוגי עובדת רק באופן חלקי (בדו"ח אנו מציינים רגישות של כ – 15%).

 

1.6 שטח הפעולה של כל משתתף, וכן תאור קצר של חלקו במחקר

החוקרת הראשית וחוקר המשנה מנהלים את מעבדת המרכז הארצי לברולוזיס וחוקרים המחלה בארץ בשיטות סרולוגיות, בקטריולוגיות ומולקולריות. החוקרת הראשית מנהלת בנוסף מעקב של האפידמיולוגיה של המחלה בארץ. חוקר המשנה אחראי לפעילות המרכז.

החוקרת הראשית נהלה את המחקר המוצע בתאום לקיחת דמים והבאתם למעבדה, ביישום הבדיקות הסרולוגיות והבקטריולוגיות, ובהשוואת התוצאות למבחנים המקובלים. חוקר המשנה עזר לחוקרת הראשית בסיכום התוצאות.

 

רשימת ספרות מצוטטת

 

Alton, G.G., Jones, L.M., Angus, R.D., and Verger, J.-M. 1988. Techniques for the brucellosis laboratory. INRA, Paris.

 

Baum, M.∗∗, Zamir, O., Bergman-Rios, R., Katz, E., Beider, Z., Cohen, A. and Banai, M. 1995. Comparative evaluation of microagglutination test and serum agglutination test as supplementary diagnostic methods for brucellosis.

J. Clin. Microbiol. 33:2166-2170.

 

Bardenstein S. and Banai M. 2010. Brucella species synchronize their life cycle to the gestation cycle of their ruminant hosts. In: Avigdor Shafferman, Arie Ordentlich, Baruch Velan (eds.). The Challenge of Highly Pathogenic Microorganisms - Mechanisms of Virulence and Novel Medical Countermeasures.  Proceedings of the 46th Oholo Conference, Eilat, Israel, October 25-29, 2009. Springer. In press.

 

Buck, J.M. 1930. Studies of vaccination during calfhood to prevent bovine infectious abortion. J. Agri. Res. 41: 667 – 689.

 

Elberg, S.S., and Faunce, Jr. K. 1957. Immunization against Brucella infection. VI. Immunity conferred on goats by a nondependent mutant from a streptomycin-dependent mutant of Brucella melitensis. J. Bacteriol. 73: 211 – 217.

 

Gall, D., and Nielsen, K. 2004. Serological diagnosis of bovine brucellosis: a review of test performance and cost comparison. Rev. sci. tech. Off. Int. Epiz. 23: 989 – 1002.

 

Ko, J.K., and Splitter, G.A. 2003. Molecular host-pathogen interactions in brucellosis: current understanding and future approaches to vaccine development for mice and humans. Clin. Microbiol. Rev. 16: 65 – 78.

 

Madkur, M.M. (ed.). 1989. Brucellosis. Butterworth, London.

 

Oliveira, S.C., Soeurt, N., and Splitter, G.A. 2002. Molecular and cellular interactions between Brucella abortus antigens and host immune responses. Vet. Microbiol. 90: 417 – 424

 

OIE. 2008. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. Six Ed., OIE, Paris.

 

Paulo, P.S., Vigliocco, A.M., Ramondino, R.F., Marticorena, D., Bissi, E., Brions, G., Gorchs, C., Gall, D., and Nielsen, K. 2000. Evaluation of primary binding assays for presumptive serodiagnosis of swine brucellosis in Argentina. Clin. Diag. Lab. Immunol. 7: 823 – 831.

 

Sammartino, L.E., Gil, A., and Elzer, P. Capacity building for surveillance and control of bovine and caprine brucellosis, Appendix 3, Expert Consultation. in: Capacity building for surveillance and control of zoonotic diseases, FAO/WHO/OIE Expert and Technical Consultation, Rome, 14-16 June 2005, FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS, Rome, 2006.

 

Young, E.J. 1995. An overview of human brucellosis. Clin. Infect. Dis. 21: 283 – 289.

 


.

טבלה 1:  השוואה של מספר המגיבות בין FPA  ו – CFT   בבדיקת עדר עיזים מחודש אחרי נגיעות בברוצלה מליטנזיס ביוואר 1.

 

 

 

 

טבלה 2:  השוואה של מספר המגיבות בין FPA  ו – CFT   בבדיקת עדרי עיזים פתוחים (לצורך איסוף עזים לבניית עדר מתחדש).

 

 

 

טבלה 3:  השוואה של מספר המגיבות בין FPA  ו – CFT   בבדיקת עדרי עיזים (סיכום כל הבדיקות).

 

 

 

טבלה 4. בדיקה לברוצלוזיס של עדר כבשים שהיו בו הפלות כתוצאה מחיסון ברוצלה מליטנזיס זן תרכיב Rev.1 בשיטת ה – FPA לעומת בדיקת המשלים (העדר נמצא בשטחי הרשות הפלשתינאית).

 

 

סה"כ נבדקו 92 דוגמאות סרום, מתוכן 8 היו חשודות מעל 90 PU, דוגמה אחת היתה שלילית אבל קרובה ל – 90 PU והיתר, 83 דוגמאות הגיבו חיובי במבחן FPA. כל הבידודים היו זן Rev. 1.

 

Information provided by the Palestinian Authority

20 animals were introduced during 2008

15 abortions and 4 human cases of the farmer's family were registered during 2008

Ocular mass vaccination was done to the flock during May 2008

Recently, 95 animal sera were positive by RBT, 65 abortions and 2 human cases


 

טבלה 5. מתאם בין בדיקות חלב לנוכחות נוגדנים לברוצלה בשיטת ה – MRT ו – FPA ובידוד חיידקי ברוצלה, בהתאמה (תוצאות שנוספו אחר דו"ח שנה ראשונה).


 

טבלה 6. בדיקה לברוצלוזיס בשיטת ה – FPA לעומת בדיקת המשלים של עדר בקר לחלב שנמצא בו בידוד זן תרכיב 19.

 

 

מפרה 648 בודד זן ברוצלה אבורטוס 19 (זן תרכיב). חלב שתי הפרות החיוביות ב – FPA ושליליות במבחן קביעת משלים היה שלילי במבחן טבעת ולא הניב ברוצלה. חלב כללי של יתר הפרות היה שלילי במבחן טבעת ולא היה בידוד בבקטריולוגיה

 

לכל המבזקים....
office@milk.org.il פקס: 972-3-9564766 טל: 972-3-9564750 דרך החורש 4 , ת"ד 97, יהוד 5647003
מופעל באמצעות מעוף - מגוון אפקט