דו"ח מסכם תוכנית מחקר 845-0262-06


חקר הפתוגניות של Porphyromonas levii, הגורם לדלקת נמקית של הבושת והנרתיק בפרות, ובחינת דרכים למניעת התסמונת

1. הקדמה
תוכנית מחקר זו בדקה היבטים שונים של תסמונת הדלקת הנימקית של הנרתיק (דנ"ן) בבקר. להלן מספר הבהרות באשר לדו"ח המסכם:
1. הפעילות המחקרית עסקה בנושאים שונים אשר הקשר היחיד ביניהם הוא כי כולם קשורים בדנ"ן. אי לכך אין אפשרות להגיש דו"ח אחד אלא יש צורך להגיש מספר דו"חות מסכמים לכל נושא ונושא. הנושאים הם:
    א. בדיקת האתיולוגיה המיקרוביאלית של דנ"ן.
    ב. בדיקת הנזקים הכלכליים העקיפים שהתסמונת גורמת.
    ג. בדיקת נוכחות החיידק P. levii במשקים וחיות שליליות לדנ"ן.
    ד. בדיקת השפעת ג'ל "משושית" על מהלך הזיהום (ראה/י סעיף 3 להלן).
    ה. הקמת מודל הוקעה בעכברים.
    ו. בדיקת השפעת חיסון עכברים על עמידותם להוקעה, על פי המודל שהוגדר בסעיף ה. לעיל.
2. חלק גדול של המחקר כבר פורסם בספרות המקצועית. חלקים אלה (סעיפים א., ב. ו-ג. לעיל) יסוכמו בקצרה ותינתן הפנייה לפרסום הרלוונטי (∗).
3. אחד מהמחקרים שהיו אמורים להיכלל בתוכנית עסקה במניעת התסמונת באמצעות פרוביוטיקה. היות והסתבר, בניגוד למה שהיה ידוע בזמן כתיבת בתוכנית, כי החיידק בו היה צריך להיעשות שימוש, Streptococcus acidominimus, עלול לגרום לזיהומים באברי המין של הפרה, הוחלט, במקום הניסוי לעיל, לבדוק אפשרות שימוש בחומר צמחי בעל פעילות אנטימיקרוביאלית והמזרז החלמת פצעים להתמודדות עם תסמונת הדנ"ן (∗).
4. כל הניסויים בבעלי חיים אושרו ע"י הוועדה המתאימה של השירותים הווטירנריים.


(∗) באישור פרופ' זאב טריינין.

 


2. מבוא כללי
בסוף 2000 ותחילת 2001 הופיעו, בעקבות הכנסת מספר גדול של פרות, התפרצויות של דלקות נמקיות של הנרתיק והבושת ב-3 משקים ברמת הגולן. בהתפרצויות אלה נפגעו בעיקר מבכירות ופרות מקומיות נפגעו פחות מאלה שהוכנסו לרפתות מבחוץ. התסמונת הוגדרה כדלקת נמקית של הנרתיק (דנ"ן) או Bovine Necrotic Vulvo-vaginitis (BNVV) (Elad et al. 2004). לאחר פרסום ותיאור התסמונת, הסתבר כי תחלואה בעלת מאפיינים קליניים דומים נצפתה גם בעבר, הן כמקרים בודדים והן כצברים של מקרים, לאחר רכישת מספר גדול של בעלי חיים. בהמשך הופיעה התסמונת, ברמות שונות של חומרה, בעוד כ-10 רפתות, תמיד בעקבות הכנסת מספר גדול של בעלי חיים ("איחודיטיס"). עד היום לא תוארה התסמונת בארצות אחרות.
החיות בסיכון גבוה הן המבכירות, בזמן שפרות נפגעו במספר נמוך, בעיקר בתחילת ההתפרצות. הפרות המקומיות היו בחלק מהאירועים בסיכון נמוך יותר מהפרות שהועברו.
הפגיעות בנרתיק והבושת בתחילת המחלה אינן שונות מאלה הנצפות בהמלטה רגילה. בהמשך, במקום להחלים, הנגעים הופכים לנמקיים. הנגעים ממוקמים במרבית המקרים בחלק האחורי של הנרתיק אך יכולים להופיע גם קרוב יותר לצוואר הרחם. משך ההחלמה הוא במרבית המקרים עד 4 שבועות אך נצפו גם מקרים חריגים של עד 10 שבועות. התחלואה והתמותה משתנות בהתאם לחומרת ההתפרצות. במקרים חמורים נצפתה תחלואה של מעל 80% ותמותה של כ-15%, בעיקר עקב דלקת רחם וצפק. בנוסף נראה כי התסמונת גורמת לנזקים עקיפים בצורת ירידה בתנובת החלב ובפוריות (Yeruham et al., 2007). נושא זה ניבדק במסגרת תוכית מחקר זו.
שטיפות מקומיות בתכשירים אנטיספטיים כמו גם טיפולים אנטיביוטיים לא היו לכאורה יעילים. אפשרות מניעת או צמצום היקף הזיהומים באמצעות מוצר צמחי ניבדק במסגרת תוכנית מחקר זו.
בבדיקות במשק אחד, היה הגורם היחיד שבודד באופן עקבי מהמבכירות החיידק בשם Porphyromonas levii. P. levii הוא מתג גרם שלילי אנאארובי, יוצר פיגמנט שחור על מצעים המכילים דם, בעל יכולת התחמקות ממנגנוני ההגנה של הפונדקאי (Elad et al. 2004). דווח בעבר כי החיידק מעורב ב:
    א. סיבוכים אחרי המלטה
    ב. דלקות טלף
    ג. דלקות עטין
הקשר בין החיידק לנגעים היה לא רק איכותי אלא גם כמותי: ככל שהנגעים היו חמורים יותר כך עלה מספר החיידקים ממין זה שבודדו מהם. הועלתה אפשרות כי נגיף הרפס הבקר מטיפוס 4 משמש כגורם סיכון מקדים לזיהומים ב-P. levii. הנחות אלה נבדקו במסגרת תוכנית מחקר זו.
למרות שבתחילה נראה היה כי כל המקרים מרוכזים ברמת הגולן, הסתבר עם השנים כי התסמונת מופיעה באזורים גיאוגראפיים שונים בישראל, עם נטייה מסוימת להתרכז בצפון הארץ.
ההערכה היא כי מדובר במחלה ממשקית המתפרצת במצבי עקה קיצוניים, וזאת עקב העובדה שכל ההתפרצויות באו בעקבות העברה ואיחוד מספר גדול של בעלי חיים.
בנוסף לנושאים שצוינו לעיל, הוקם מודל הוקעה בעכברים ונעשה ניסיון לחסן עכברים, על סמך מודל זה.


3. בדיקת האתיולוגיה המיקרוביאלית של דנ"ן
במעקב שבוצע במשק נגוע בשנת 2001-2 (Elad et al., 2004) נקשר לראשונה P. levii לדנ"ן. קשר כזה לא נמצא בין חיידקים אחרים שבודדו מהמקרים לתסמונת. למרות שבאותו המשק היו גם אבחנות של נגיף הרפס מטיפוס 4, בחינה סטטיסטית של הממצאים הראה שאפשרות קיום קשר בין הנגיף לתסמונת קלוש.
בחלק זה של המחקר הורחבה מתכונת הבדיקות ונבדקו הקשר בין נוכחות P. levii לתסמונת הן מבחינה איכותית (יש/אין) והן מבחינה כמותית (מספר המושבות/חומרת הנגעים). בנוסף נבדק שוב קשר אפשרי בין חיידקים אחרים שכיחים בדרכי המים של הפרות (Escherichia coli, alpha haemolytic Streptococcus spp., Arcanobacterium pyogenes או רמת זיהום כללית) ונגיף הרפס הבקר מטיפוס 4, בכלים משופרים לעומת המעקב הראשוני, לבין תסמונת הדנ"ן.
נבדקו 287 מטושי נרתיק מ-104 מבכירות במשק אנדמי למחלה, במצבי ושלבי תחלואה שונים. המטושים נבדקו הן בתרביות אארוביות והן בתרביות אנאארוביות. הנגעים סווגו בהתאם לרמת חומרתם מ-1 (ללא נגעים) ועד 5 (נמק מפושט עם מעורבות הבושת). התרביות סווגו בהתאם למספר החיידקים מ-1 (ללא צמיחה) ועד 4 (צמיחה עשירה בצורת רובד). הקשר בין דרגת חומרת הנגעים לכמות החיידקים בתרבית נבדק במודל ordinal regression, אשר נועד לבחון נתונים שהם תוצאה של שיפוט סובייקטיבי.
תשע עשר דגימות נבדקו וירולוגית לנגיפי הרפס מטיפוסים 1, 2, 4, ו-5.
התוצאות הראו קשר משמעותי ביותר (p<0.01) בין חומרת הנגעים לכמות חיידקי ה-P. levii. לא נמצא קשר בין חיידקים אחרים, לבד או בתרבית מעורבת, לתסמונת. כל הדגימות היו שליליות לכל נגיפי ההרפס הבקר שנבדקו.
ממצאים אלה מאוששים את ההנחה כיP. levii הוא הגורם לדנ"ן. כמוכן עולה מהתוצאות כי נגיפי הרפס הבקר אינם מהווים גורם סיכון הכרחי לתסמונת.
פירוט נוסף למחקר זה ניתן למצוא במאמר הרלוונטי (Blum et al., 2007).


4. בדיקת הנזקים הכלכליים העקיפים שהתסמונת גורמת
בבדיקה מקדימה נמצא (Yeruham et al., 2007) כי בנוסף לנזקים הישירים (טיפול, צורך להוציא פרות חולות מהעדר עקב סיבוכים כגון דלת הצפק) יש גם נזקים עקיפים הקשורים לירידה בתנובת החלב ובפוריות. נתונים אלה נבדקו בצורה מפורטת יותר במשק אחר ובמספר פרות גדול יותר. נבדקה תנובת החלב, ימי הריק וקצב ההוצאה מהעדר.
מאה ושתי מבכירות מרפת אחת נכללו בסקר, מהן 29 פתחו דנ"ן. במהלך המעקב הוצאו 21.92% ו-20.69% מהמבכירות השליליות והחיוביות לדנ"ן, בהתאמה, עקב בעיות תנובנה או פוריות.
לא נמצאו הבדלים בתנובת החלב וימי הריק בין המבכירות המקומיות למבכירות שהועברו ממשק אחר. כמוכן לא נמצא הבדל בתנובת החלב בין מבכירות שנפגעו בדנ"ן לבין אלה שלא נפגעו.
ההבדל המשמעותי (P = 0.043) היחיד, מבין המשתנים שנבדקו, היה בימי הריק.
פירוט נוסף למחקר זה ניתן למצוא במאמר הרלוונטי (Blum et al., 2008).


5. בדיקת נוכחות החיידק P. levii במשקים וחיות שליליות לדנ"ן
מאחר ולא נמצאו גורמים מסייעים אחרים, ההנחה היא כי רמה גבוהה של עקה היא גורם הסיכון המרכזי ללקות בדנ"ן. היות והיארעות התסמונת בפרות בתחלובה שנייה והילך היא שולית והיות והמחלה מופיעה בראש וראשונה לאחר מיזוגי עדרים גדולים של פרות, אפשר להניח כי שילוב עקת התובלה, המאבקים החברתיים בקבוצות החדשות וההמלטה (הגבוהה במיוחד במבכירות), סביר להניח כי פעילות משולבת של כל גורמי עקה אלה מביאה לירידה ביכולת העמידות החיסונית של המבכירה ומאפשרת התפתחות דנ"ן. מצד שני, ייתכן שבמשקים בהם התסמונת לא נצפתה, למרות שהן עברו תהליך איחוד, החיידק פשוט לא נמצא. הפרק הנוכחי במחקר בא ללבן נקודה זו.
במעקב נכללו 3 משקים בהם לא אובחן לדנ"ן: אחד שעבר איחוד כחצי שנה לפני הדיגום ובו נשמרו המבכירות בקבוצה נפרדת, ושניים שעמדו לפני איחוד. על פי הנחיתנו, נשמרו גם כאן המבכירות משני המשקים, לאחר האיחוד, בנפרד משך כחצי שנה.
נבדקו מבכירות ופרות, לאחר המלטה. פציעות לא נמקיות, תואמות את המצופה לאחר המלטה, נצפו בנרתיק של כל החיות שנבדקו. P. levii בודד מחלק מהחיות מכל המשקים במעקב, תמיד במקביל לנוכחות פציעות בנרתיק. נגיף הרפס הבקר מטיפוס 4 לא בודד.
במשק המאוחד שנכלל במעקב הפרוספקטיבי לא היו אירועי דנ"ן.
תוצאות סקר זה מראות כי אי התפתחות דנ"ן אינה נובעת מהיעדר החיידק במשקים השליליים. הם מחזקים את ההנחה כי שילוב גורמי עקה מהווה את גורם הסיכון המרכזי להתפתחות התסמונת. הנחה זו תואמת את הממצא שהוצאת גורם עקה אחד, המאבקים החברתיים, מנעה את הופעת התסמונת, למרות שכל הגורמים האחרים (העברה והמלטה ראשונה) פעלו גם במשקים השליליים.
פירוט נוסף למחקר זה ניתן למצוא במאמר הרלוונטי (Blum et al., accepted).


6. בדיקת השפעת ג'ל "משושית" על מהלך הזיהום
מבוא
"משושית" הינה מוצר צמחי של חברת "מורז" אשר משווק במשחה או בג'ל. במחקר על השפעתו על כוויות שנערך בבי"ח ב"הדסה" (Kaufman and Ullman, 1989) נמצא, במודל בחיות ניסוי, כי למשחה פעילות זירוז יצירת רקמת גראנולציה לאחר כוויות. חוקרים אלה מעלים אפשרות כי פעולה זו קשורה בשימור זרם הדם בעור.
P. levii הינו חיידק אנאארובי הכרחי. ייתכן, לכן, כי יכולתו ליישב פצעים שנוצרים בבושת לאחר המלטה קשורה בהפרעות זרם הדם לרקמה אשר יוצרים תנאי מתח חמצון נמוך ומאפשרים את שגשוג החיידק. לאור זאת נמצאה הצדקה לנסות לטפל במבכירות ב"משושית", בכוונה לשפר את זרם הדם מצד אחד ולזרז את תהליך ההבראה של רירית הנרתיק הפגועה וכך למנוע או לפחות לצמצם את מופע הדנ"ן.


שיטות וחומרים
ניסיונות מקדמיים שנעשו במשחת "משושית" הראו כי קיים קושי רב ביכולת הפיזור בנרתיק. הוחלט לכן לעבור למוצר בג'ל אותו ניתן להכניס לנרתיק באמצעות למזרק.
בניסוי השתתפו 39 מבכירות, מחולקות ל-3 קבוצות:
  1. קבוצת ביקורת לא מטופלת (14 מבכירות)
  2. קבוצה שטופלה בפלסבו (ג'ל ללא חומר פעיל) (12 מבכירות)
  3. קבוצה שטופלה בג'ל עם החומר הפעיל (13 מבכירות)
השיבוץ לקבוצות נעשה על פי סדר ההמלטה. הטיפולים נעשו ע"י הרפתן והוא היה היחיד שידע את שיוך המבכירה לקבוצה. כל מבכירה בקבוצות 2 ו-3 טופלה משך 3 ימים לאחר ההמלטה, פעם ביום עם 50 סמ"ק ג'ל, שהוכנס לנרתיק באמצעות מזרק.
קביעת נגיעות בדנ"ן וחומרתה נקבעה ע"י הרופא המטפל, בביקור הראשון 3-4 ימים לאחר ההמלטה. הדירוג היה 0 כאשר לא היו סימני דנ"ן, 1, 2 או 3 במעורבות של 25% או פחות, 50% או 75% ומעלה של רירית הנרתיק, בהתאמה.


תוצאות
מתוצאות הניסוי (טבלה 6.1) עולה כי למרות שהייתה השפעה חיובית של הטיפול, היא לא הייתה משמעותית ולא מצדיקה את העבודה הרבה הדרושה לטיפולים. הוחלט, לכן, כי אין הצדקה להמשך הטיפול.


בטבלה 6.1: התפלגות הנגיעות בדנ"ן וחומרתה במבכירות שטופלו ב"משושית"

 

7. הקמת מודל הוקעה בעכברים
מבוא
הצורך בניסוי זה התעורר עקב חוסר ההצלחה לגרום לתופעות קליניות בהדבקה ב-P. levii, וכתוצאה מכך היעדר מודל לחקר הזיהום ואפשרות למונעו. נבחנה, לכן, האפשרות ליצור מודל שיבדוק האם קיימים יחסי גומלין של הדדיות בין חיידק זה לבין A. pyogenes. חיידק זה נבחר עקב שכיחות הימצאותו באברי המין של פרות, כפתוגן מזדמן, ועקב קשרי הדדיות מתועדים (Roberts, 1967) בינו לבין Fusobacterium necrophorum, אף הוא, בדומה ל-P. levii מתג גרם שלילי אנאארובי ממשפחת ה-Bacteroidaceae.
מציאת יחס כזה היה מאפשר, למשל, לבחון חיסון עכברים ב-P. levii, בהנחה שאם חיסון כזה יעיל, הוא ישווה את חומרת תוצאות ההוקעה בשילוב של A. pyogenes ו-P. levii לרמה של זיהום ב-A. pyogenes לבד עקב נטרול רכיב ה-P. levii בשילוב.


שיטות וחמרים
השיטה שאומצה לניסוי זה הוא מודל יצירת מורסה בעכברים, עליה שדווח בעבר (Kolenbrander at al., 2002; Yoneda et al., 2002; Yoneda et al., 2005) בהם נבדקה הדדיות (mutualism) ביןP. gingivalis וחיידקי לוע אחרים כגון Fusobacterium nucleatum, Tanerrella forsythia, Bacteroides forsythus.
על מנת לצמצם ככל האפשר את מספר החיות בניסוי, הוא בוצע ב-3 שלבים, כאשר כל שלב מבוסס על התוצאות של קודמו.
בשלב הראשון פותחה שיטה אשר באמצעותה ניתן לגרום ליצירת מורסה ע"י הזרקה תת עורית של A. pyogenes. נמצא המטען החיידקי הדרוש לכך ובוצע מעקב לאחר התפתחות הזיהום.
בשלב השני נבחנה המנה של P. levii אותה יש לשלב עם A. pyogenes, במינון שהוגדר בשלב הראשון, ע"מ לקבל תופעת הדדיות בין שני החיידקים, כלומר הגברת הסממנים הקליניים (חומרת ומשך המורסות) של הזיהום בהשוואה להדבקה ב-A. pyogenes לבד. ניסוי זה נעשה תוך שילוב ריכוזים שונים של החיידקים בשיטת "לוח השחמט" (checkerboard). על מנת לתת תוצאות חד משמעיות, עלולה שיטה זו לדרוש מספר גדול של חיות ניסוי. נעשה מאמץ לצמצם מספר זה למינימום, מתוך ידיעה שקיימת אפשרות שעקב שונות ביחסי טפיל/פונדקאי בין העכברים, יהיה קושי במתן פירוש לתוצאות. יחד עם זאת הוחלט להסתפק בתוצאה שתאפשר את הרחבת הניסוי בשילוב אחד, בשלב השלישי.
בשלב השלישי הועלה מספר העכברים שהוזרקו במינוני שילובי החיידקים שהוגדרו בשלב השני ע"מ לבחון את תופעת ההדדיות בצורה סטטיסטית.
חיידקי ה-P. levii וה-A. pyogenes בהם נעשה שימוש בודדו ממקרי דנ"ן. הם הוגדרו באמצעות ערכות ID32 Anaerobes ו-API Coryne (BioMerieux, France), בהתאמה.
מספר החיידקים נקבע באמצעות קורא עכירות (Hanna Instruments, UK) לאחר שנקבעה עקומת עכירות/יחידות יוצרות מושבות (יי"מ) (colony forming units) באמצעות סופר מושבות (Symbiosis, UK).
בניסוי השתתפו עכברים מסוג Swiss White זכרים, בני חודש. הם הוזרקו תת-עורית במפשעה עם תרחיף חיידקים ב-0.5 סמ"ק סליין או סליין לבד (ביקורות). לאחר ההזרקה, תורבתו התרחיפים לוידוי חיות החיידקים. העכברים נבדקו לפחות פעם ביום משך שבוע להתפתחות מורסה במקום ההזרקה ומצב קליני כללי (חיות, שיער סמור, קשיי תנועה ברגל המוזרקת).
לאחר שהורדמו (באמצעות כלורופורם), בוצעו תרביות אארוביות ואנארוביות מאתר ההזרקה, כבד, טחול, כליה, ריאה, דם ומח. האברים נזרעו על מצעי אגר דם (5% דם כבש), אגר מזין (Nutrient agar) ואגר McConkey (Becton Dickinson, USA). התרביות נבדקו לאחר 5 ימי הדגרה ב-37 °C.
הנפיחות במקום ההזרקה דורגה כלהלן:
  0-היעדר נפיחות ברורה
  1-נפיחות ברורה אך קלה
  2-נפיחות משמעותית
כמות החיידקים בתרביות דורגה כלהלן:
  0-אין צמיחה
  1-עד 20 מושבות
  2-צמיחה עשירה אך במושבות נפרדות
  3-צמיחה ברובד (confluent)
בשלב הראשון של הניסוי הוזרקו ריכוזים של 10/6, 10/7, 10/8 and 10/9 יי"מ, כל ריכוז לשני עכברים. שני עכברים הוזרקו בסליין, כביקורת.
בשלב השני הוזרקו העכברים בשילוב של A. pyogenes בריכוזים הנמוכים בסדר גודל אחד או שניים מזו שגרמה לתופעות החמורות ביותר הראשון, כך שניתן יהיה להעריך את החמרת הסימנים הקליניים, (107 and 108 יי"מ) ו-10/6, 10/7, 10/8 או 10/9 יי"מ P. levii. כל ריכוז הוזרק לשני עכברים. שני עכברים נוספים הוזרקו בסליין, לביקורת.
בשלב השלישי הוזרקו 10 עכברים ב-A. pyogenes בריכוז 10/8 יי"מ, 10 עכברים בשילוב שלA. pyogenes באותו ריכוז ו-P. levii בריכוז 10/9 יי"מ (השילוב המינימאלי שנמצא יוצר תופעת הדדיות) ושני עכברים בסליין, לביקורת.
משמעות התוצאות נבדקה בתבחין Two-sample T-test בתוכנת Statistix גרסה 7.


תוצאות
שלב ראשון: התגובות במקום ההזרקה היו תלויות מינון. מורסה התפתחה לאחר 24 שעות בעכברים שהוזרקו ב-10/7, 10/8 ו-10/9 יי"מ אך לא באלה שהוזרקו ב-10/6 יי"מ. עכברים שהוזרקו ב-10/7 יי"מ הראו נפיחות קלה (דרוג 1) משך יומיים, אלה שהוזרקו ב-10/8 יי"מ הראו נפיחות קלה (דרוג 1) משך שבעת ימי המעקב ואלה שהוזרקו ב-10/9 יי"מ הראו נפיחות חמורה (דירוג 2) משך תקופה זו.
גם כמות המוגלה הייתה ביחס ישיר לכמות החיידקים שהוזרקה. לא נמצאה מוגלה בזמן הנתיחה (7 ימים לאחר ההדבקה) בקבוצה שהוזרקה בריכוזים של 10/6 ו-10/7 יי"מ. כמות המוגלה בקבוצה שהוזרקה ב-10/9 יי"מ עלתה על זו שנמצאה בעכברים שהוזרקו ב- ב-10/8 יי"מ. לא נמצאה מוגלה בעכברי הביקורת.
התפשטות החיידקים מאתר ההזרקה הייתה אף היא ביחס ישיר למינון ההזרקה (טבלה 7.1).
שלב שני: מבין העכברים שהוזרקו בשילוב של 10/7 יי"מ A. pyogenes וריכוזים שונים של P. levii, רק אלה שקבלו את הריכוז הגבוה ביותר של זה האחרון, 10/9 יי"מ, הראו נפיחות קלה (דרוג 1) במקום ההזרקה. התוצאות של השילובים שהכילו 108 יי"מ A. pyogens וריכוזים שונים של P. levii היו שונים אך אלה שהוזרקו ב-/109 יי"מ P. levii הראו את התגובות הקשות ביותר, כמפורט בטבלה 7.2.


טבלה 7.1: התפשטותA. pyogenes לאברי עכברים על פי מינון ההזרקה והערכה כמותית של החיידקים בכל איבר ואיבר

 

בתוצאות השלב השלישי (טבלה 7.3) נמצא כי ממוצע ימי הנפיחות שנצפתה בעכברים שהוזרקו ב-108 יי"מA. pyogenes לבד היה 4.7 בזמן שערך זה בקבוצה שהוזרקה ב- ב-108 יי"מA. pyogenes בשילוב 109 יי"מ P. levii היה 10.2. הבדל זה נמצע משמעותי סטטיסטית (p=0.0312 ל-variance בלתי שווה (p=0.0188)).
תרביות אארוביות ואנאארוביות מאתר ההזרקה הראו כי A. pyogenes שרד במקום ההזרקה בכל העכברים. P. levii לעומת זאת נמצא במקום ההזרקה רק בעכבר אחד, ליומיים לאחריה (נבדק בניסוי נפרד ב-6 עכברים שהוקרבו יום, יומיים ושלשה ימים לאחר ההזרקה, 2 עכברים כל פעם).
במהלך כל הניסויים לא הראו העכברים שום סימני סבל כלליים כגון ירידה בפעילות או שיער סמור.


טבלה 7.2: תגובה באתר הזרקת של עכברים שהוזרקו ב-108 יי"מ A. pyogenes וריכוזים שונים של P. levii

 

טבלה 7.3: משך נוכחות מורסות בעכברים (ימים)


סיכום דיון
במסגרת ניסוי זה הושגו מספר מטרות:
1. פותח מודל יצירת מורסות בהזרקתA. pyogenes תת עורית לעכברים בו נמצא כי המינון המינימאלי לגרימת מורסות הוא 10/7 יי"מ.
2. נמצא שילוב A. pyogenes ו-P. levii שהראו הדדיות.
3. כאשר מספר העכברים הורחב לבדיקה סטטיסטית של תוצאות השילוב, נמצא כי אכן ההבדלים בין משך ההחלמה של עכברים שהוזרקו ב-A. pyogenes לבד לבין זה של עכברים שהודבקו שילוב A. pyogenes ו-P. levii היה משמעותי סטטיסטית.
כצפוי, הייתה השונות בין הערכים שהתקבלו מהעכברים בניסוי גבוהה כתוצאה מהבדלים ביחסי טפיל/פונדקאי לכל חיה וחיה. דבר זה גרם לבעיה בעיקר בשלב השני של הניסוי בו כללה כל קבוצה 2 עכברים בלבד. יחד עם זאת, היות ומטרת שלב זה הייתה מציאת צרוף מתאים לבדיקה בשלב השלישי, נראה כי השלב השני השיג את מטרתו וזאת תוך שימוש במספר מינימאלי של חיות מעבדה.
מעניינת העובדה שכמעט בכל המקרים שנבדקו לא שרד P. levii במקום ההזרקה 24 שעות. ייתכן מאד, לכן, כי הגורם להדדיות הוא לא החיידק עצמו אלא אחד הרכיבים שלו, כגון ה-lipopolysaccharide.
לסיכום נראה כי בניסוי זה אכן פותח מודל לבדיקת אפשרות מניעת הזיהום ב-P. levii בעכברים אליו מתייחס הפרק הבא.


8. בדיקת השפעת חיסון עכברים עמידותם להוקעה
שיטות וחומרים

בניסוי זה ייושם המודל שפותח בשלב הקודם.
הניסוי בוצע על עכברי Swiss White על פי הקבוצות הבאות:
    1. 20 עכברים חוסנו בגיל 3 שבועות ופעם נוספת בגיל 5 שבועות
    2. 20 עכברים חוסנו פעם אחת בגיל 5 שבועות
    3. 14 עכברים הוזרק בחצי סמ"ק סליין
הזריקות נתנו במפשעה השמאלית.
כל העכברים הוקעו בגיל 7 שבועות (שבועיים לאחר החיסון האחרון), תוך שרירית, במפשעה הימנית.
העכברים חוסנו בתרחיף של 109 חיידקי P. levii בחצי סמ"ק סליין.
תרחיף ההוקעה כלל 8.6∗108 (מסיבות טכניות לא הייתה אפשרות להגיע ל-109 חיידקים) חיידקי P. levii ו-108 חיידקי Arcanobacter pyogenes בחצי סמ"ק סליין.
העכברים נבדקו מדי יום משך 7 ימים להופעת מורסות במקום ההוקעה.


תוצאות ודיון
בניגוד לתוצאות במודל, לא נצפו שינויים פתולוגיים באתר ההוקעה. סביר להניח כי דבר זה נבע מהבדלי הגיל בין העכברים שנעשה שימוש במודל (4 שבועות) לאלה בניסוי החיסון (7 שבועות). להערכתנו אין משמעות להבדל במנת ההוקעה ב-P. levii לעומת המודל (8.6∗108 במקום 109). היות ואין אפשרות לחסן עכברים ולהוקיע אותם בגיל צעיר יותר ממה שנעשה בניסוי זה, אין אפשרות להסיק מסקנות באשר לאפשרות להשרות הגנה באמצאות חיסון ב-P. levii במודל עכבר.


9. בדיקת השריית יצירת נוגדנים ע"י חיסון ב-P. levii
שיטות וחמרים

על מנת להפיק תועלת מניסוי זה, דוממו העכברים שהשתתפו בניסוי החיסון, שבועיים לאחר ההוקעה. ההתייחסות לשלושת קבוצות העכברים הייתה כדלהלן:
    1. קבוצת הביקורת חוסנה פעם אחת (ההוקעה): 10 עכברים
    2. קבוצה שחוסנה פעמיים (חיסון והוקעה): 20 עכברים
    3. קבוצה שחוסנה 3 פעמים (2 חיסונים והוקעה): 20 עכברים
    4. קבוצה שהוזרקה בסליין: 4 עכברים
הנסיובים נבדקו לנוכחות נוגדנים במערכת ELISA שפותחה במסגרת תוכנית מחקר 846-0301-08 ופרטיה יפורטו בדו"ח תוכנית זו. בקצרה, פלטות 96 בארות (Nunc, Amstrup, Denmark) צופו באנטיגן שבור של P. levii (30 מיקרוגרם/פלטה, 200 מיקרוליטר/באר) למשך הלילה ב 4 מ"צ. לאחר שלוש שטיפות בפוספט בופר עם 0.05%Tween הבארות "נחסמו" ב 3% קזאין והודגרו למשך 45 דקות ב 37 מ"צ. לאחר שלוש שטיפות נוספות, הוכנס לתוך הבארות 100 מיקרוליטר נסיוב במהול 1:100, 1:200 ו- 1:400, כל מהול לשתי בארות והפלטה הודגרה למשך 60 דקות ב 37 מ"צ. לכל פלטה הוסף נסיוב של עכברים שלא חוסנו בחיידק, באותם המהולים, ושמשו כנסיוב שלילי. בהמשך נשטפו הפלטות כנ"ל ולכל הבארות הוסף 100 מיקרוליטר נוגדן שניוני כנגד נוגדני עכברים (Goat anti-mice IgG heavy and light-chain- Jackson, CA) קשור לאנזים פרוקסידז במהול של 1:5000, והפלטה הודגרה למשך 60 דקות ב 37 מ"צ. בסוף ההדגרה, נשטפה הפלטה שלוש פעמים ו-100 מיקרוליטר של סובסטרט (TMB – Chemicon, CA) הוסף לכל באר. הפלטות נקראו במכשיר Genius Plus (TECAN, Austria) ) באורך גל של nm 650. רמת הנוגדנים חושבה לפי הנוסחה (OD sample/OD negative) - 1
משמעות התוצאות נבדקה בתבחין Two-sample T-test בתוכנת Statistix גרסה 7.


תוצאות
תוצאות הניסוי מוצגות בטבלה 10.1.


טבלה 10.1: ערכי OD במבחן ELISA בעכברים שחוסנו ב-P. levii

 

בהשוואה בין הקבוצה שקיבלה חיסון אחד לקבוצה שקיבלה שני חיסונים נמצא כי שתי הקבוצות נבדלות זו מזו באופן משמעותי (p=0.0155 כאשר ה-variance בין הקבוצות שונה משמעותית (p=0.0088)).
גם בהשוואה בין הקבוצה שקבלה חיסון אחד לזו שקבלה שלושה חיסונים נמצא כי הקבוצות נבדלות זו מזו באופן משמעותי (p=0.0124 כאשר ה-variance בין שתי הקבוצות לא נבדל משמעותי (p=0.0788)).
הקבוצות שקבלו שני חיסונים או שלושה חיסונים לא נבדלו זו מזו (p=0.9327 כאשר ה-variance בין שתי הקבוצות לא נבדל משמעותי (p=0.0712)). ארבעה עכברים שקבלו זריקות סליין לא הראו תגובה כלשהי במבחן.


מסקנות ודיון
תוצאות הניסוי מראות באופן מובהק כי יש תגובה הומוראלית להזרקת חיידקי P. levii, כי חיסון שני יוצר הגברה משמעותית של תגובה זו וכי לחיסון שלישי אין השפעה נוספת.


10. סיכום כללי ודיון
את סדרת הניסויים והמעקבים שבוצעו במסגרת תוכנית מחקר זו ניתן לחלק לשתי קבוצות:
1. שדה
2. מעבדה
מניסויי השדה עולים מספר מסקנות:
1. P. levii הוא הגורם לדנ"ן.
2. נגיפי הרפס אינם גורמי סיכון הכרחיים להופעת התסמונת.
3. P. levii נמצא בנרתיק של פרות/מבכירות גם במשקים שאינם סובלים מדנ"ן בקשר הדוק ביותר עם פגיעה בשלמות הריריות.
4. שילוב גורמי עקה הכוללים גורמים ממשקיים כגון הובלה, ערבוב חברתי וכו' ועקת ההמלטה, החריפה במיוחד בעגלות, הם ככל הנראה גורם הסיכון המרכזי להתפתחות דנ"ן. אף לא אחד מהגורמים הנ"ל לא גורם לבד להופעת דנ"ן.
5. הנזק הנגרם ע"י התסמונת, בנוסף לנזקים הישירים, הוא עליה בימי הריק. נראה כי תנובת החלב נפגעת בתחילת התחלובה אך מתאזנת בהמשכה. נתונים אלה נבדקו במשק אחד עם נגיעות בינונית. מן הראוי שיבדקו במשקים נוספים עם רמות נגיעות שונה.
6. השפעת הטיפול ב"משושית" על היארעות וחומרת מקרי הדנ"ן הייתה שולית.


מטרת ניסויי המעבדה הייתה לפתח מודל הדבקה ב-P. levii בעכברים ולנצל מודל זה על מנת לבדוק את האפשרות להגן על חיות אלה ע"י חיסון בחיידק. היות ולא נמצאה אפשרות להדביק עכברים בחיידק לבד נעשה ניסיון לנצל תופעת הדדיות בין P. levii ל-A. pyogenes למטרה זו והיא אכן הושגה. נמצא כי הדבקה משולבת של שני החיידקים יוצרת מורסה אשר משך החלמתה ארוכה יותר מאשר הדבקה ב-A. pyogenes לבד (כאמור P. levii לבד לא יוצר שום תגובה). המטרה השנייה, לחסן עכברים עם P. levii לא עלה יפה היות וככל הנראה עקב הבדלים בלתי נמנעים בין המודל לחיסון (גיל העכברים בזמן ההוקעה), לא התפתחו מורסות, גם לא בחיות הביקורת. לאור זאת הוחלט לבדוק האם החיסונים השרו יצירת נוגדנים בעכברים. נמצא כי אכן נוצרים נוגדנים, חיסון שני מהווה booster אך לאחר מכן אין השפעה נוספת לחיסון שלישי. ממצאים אלה פותחים את הדרך לבדיקת אפשרות חיסון בבקר.


11. מקורות ספרות

לכל המבזקים....
office@milk.org.il פקס: 972-3-9564766 טל: 972-3-9564750 דרך החורש 4 , ת"ד 97, יהוד 5647003
מופעל באמצעות מעוף - מגוון אפקט