מיפוי עדין של כרומוסום 6 בעזרת תערובות חלב של קבוצות קצה.
דו"ח שנתי – 1.1.2004-31.12.2004
חוקרים: פרופסור אדם פרידמן, דוקטור אהוד ליפקין, פרופסור משה סולר, המחלקה לגנטיקה, האוניברסיטה העברית בירושלים.
מספר תקציב: 0397158.
מממן: המועצה לענף החלב.
תכנית מחקר: 8290081.
Abstract

Numerous studies in Israel and around the world indicate that there are a number of Quantitative Trait Loci (QTL) located on the bovine chromosome 6 (BTA6).
These QTLs affect milk production traits (milk yield, protein yield and
percent, fat yield and percent), as well as minor traits (body type, growth,
somatic cell concentration, resistance to mastitis, coat color and fertility).

In previous years we used selective milk DNA pooling in a daughter design to scan the entire chromosome (15 dinucleotide microsatellites), for QTL affecting protein percent (PP; 13 sires), Protein yield (PY; 10 sires), and milk yield (MY; 10 sires). Haplotypes (HT) were identified according to the genotypes of the sire or the daughters of the sire. Based on the HT analysis, and taking into account the distribution of the significant effects over the chromosome, we identified at least five QTL containing regions (QTLR). These results were confirmed by the analysis of the dam alleles.

In the year 2002 we collected milk samples of daughters of seven sires, belong to the phenotypic tails for PP, and from daughters of the sire Scorer belong to the phenotypic tails for PY. In the year 2003 we collected milk samples of daughters of Scorer belong to the phenotypic tails for PP, and of daughters of six sires (Scorer included), belong to the phenotypic tails for female fertility (FF) and milk somatic cell count (MSCC). From Scorer daughters four random pools were prepared in one copy for each tail for PP and PY. From all other sire-trait combinations two random pools were prepared for each tail, two independent duplicates for each pool. All pools are being used for a third scan of the chromosome for PP, and to identify the effects of the identified QTL on FF and MSCC.

Even though very strong significant effects on PP were found in all four scans, a clear reduction in the magnitude was seen from 1996 to the later four scans. Careful examination of the results of the individual sires indicate that some of the sires in the 1996 sample had a linkage coupling phase between the QTLs, and accumulation of otherwise moderate effects of adjacent QTLs resulted in the extreme effects found in that year. In accord with this notion, no such reduction was found by the analysis of the dam alleles.

The markers tested in 2004 indicate the presence of a QTL affecting MSCC near the center of the chromosome. In the same region others reported similar effects previously. Furthermore, a few candidate genes with known effects on this trait were mapped to the same region.
תקציר
רצף של מחקרים שנעשו בישראל ובעולם מצביעים על כמה את"כים (QTL) הנמצאים בכרומוסום 6 של הבקר. האת"כים השונים משפיעים על כל התכונות לייצור חלב (כמות חלב, וכמות ותכולת חלבון ושומן). בנוסף, נמצאו על כרומוזום זה את"כים המשפיעים על תכונות משניות (תכונות גוף, גדילה, ריכוז תאים סומטיים, רגישות לדלקות עטין, צבע העור, פוריות).

בשנים קודמות סרקנו את הכרומוסום במלואו בעזרת תערובות חלב של קבוצות קצה של בנות פרים (15 מיקרוסטליטים דו בסיסיים) לתכונות אחוז חלבון (סה"כ 13 פרים), ייצור חלבון (10 פרים) וייצור חלב (10 פרים). הפלוטיפים (ה"ט) נקבעו בעזרת האב או הבנות של הפר. על סמך אנליזת הה"ט ובהתחשב בפיזור האפקטים המובהקים ע"פ הכרומוסום, זיהינו לפחות חמישה אזורי את"כים. תוצאות אלה אושרו באנליזה על בסיס האללים האימהיים.

בשנת 2002 אספנו דוגמאות קצה לאחוז חלבון משבעה פרים, ולייצור חלבון מהפר סקורר; בשנת 2003 אספנו דוגמאות מסקורר לאחוז חלבון, ומשישה פרים (כולל סקורר) לפוריות נקבית ולריכוז תאים סומטיים בחלב (רת"ס). מבנות סקורר שנאספו לק"ג ולאחוז חלבון הכנו ארבע תערובות חלב אקראיות בהעתק יחיד לכל קצה; מבנות שאר הפרים ובנות סקורר שנאספו לפוריות ורת"ס, הכנו שתי תערובות אקראיות לקצה, כל תערובת בשני העתקים בלתי תלויים. כל התערובות שהוכנו שמשו ומשמשות לסריקה שלישית של הכרומוסום עם המשפחות החדשות לאחוז ולייצור חלבון, ולזיהוי ההשפעות של האת"כים שנמצאו על פוריות ורת"ס.

בכל ארבע הסריקות, 1996, 1998, 2002 ו-2003, נמצאו אפקטים מובהקים מאד לאחוז חלבון. עם זאת נמצאה ירידה בעוצמת האפקטים מסריקת 1996 לכל הסריקות הבאות. בחינה מדוקדקת ברמת הפר הבודד מראה כי ככל הנראה היה צירוף מקרים מיוחד בשנת 1996; על פי אנליזת הה"ט נראה שבשנה זו היו כמה פרים בהם התקיים מצב תאחיזה צמוד (linkage coupling phase) בין את"כים שכנים, והצטברות אפקטים בינוניים לכשעצמם של את"כים שכנים, היא שהניבה את האפקטים הקיצוניים של שנה זו. חיזוק להשערה זאת היא העובדה שמגמת ירידה דומה לא נצפתה באנליזת האללים האימהיים.

הסמנים שנבדקו במהלך 2004 מצביעים על נוכחות את"כ לרת"ס לפני וקרוב למרכז הכרומוזום. באזור זה נמצאו במעבדות אחרות אפקטים וגנים המשפיעים על תכונה זו.
שיטות ומהלך העבודה
ברחבי עולם, במגוון של גזעים, עדרים, אזורי אקלים, שיטות ממשק, הזנה וחליבה, נמצאו תוצאות רבות המצביעות על כך שעל כרומוסום 6 של הבקר ממוקמים כמה וכמה את"כים לתכונות חלב, פוריות ובריאות עטין (הדיווחים נסקרים ברובם ב-Mosig et al., 2001, וראו גם http://www.vetsci.usyd.edu.au/reprogen/QTL_Map/). תוצאות דומות נמצאו בארץ במעבדתנו (Lipkin et al., 1998; Tchourzyna et al., 1999; Mosig et al., 2001) ואומתו מאוחר יותר ע"י רון וחוב' (Ron et al., 2001). מטרת העבודה הנוכחית היא להגדיר ביתר דיוק את מספר האת"כים הנמצאים על כרומוסום זה, השפעתם על סת"ס ופוריות, ומיקומם על פני הכרומוסום.

כיום אנחנו נמצאים בשלב הרביעי של העבודה:

1. דוגמאות חלב שנאספו בשנים 1996 ו-1998 שימשו להכנת תערובות קצה של בנות פרים. עד היום נבדקו בכרומוזום זה 15 סמנים (מיקרוסטליטים דו-בסיסיים), עם תערובות לאחוז חלבון, ק"ג חלבון וק"ג חלב. הבדיקה נעשתה ב-13 משפחות בתי אב לאחוז חלבון, ובעשר מאותן משפחות לק"ג חלבון וק"ג חלב.

2. ה"ט של פרי המיפוי נקבעו בעזרת אב או בנות הפר. ובהתחשב בפיזור האפקטים המובהקים וכוון האפקט הקשור לכל אחד מהה"ט, של הפר (אבהי או אימהי) זוהו לפחות חמישה אזורי את"כים (QTL region, QTLR). כל האת"כים שנמצאו משפיעים ככל הנראה על כל שלוש התכונות שנבדקו בשלב זה (Tchourzyna et al., 1999).

3. במקביל לאנליזה של האללים האבהיים, בוצעה אנליזה של האללים האימהיים (אללים שאינם של הפר). האנליזה התבססה על תוצאות התערובות ששימשו גם למבחן האללים האבהיים, וכללה רק אללים ששכיחותם הממוצעת בקבוצות הגבוהות והנמוכות ביחד, הייתה לכל הפחות 5%.

4. בשנת 2002 אספנו דוגמאות חלב מקבוצות קצה לאחוז חלבון מבנות שבעה פרים נוספים, ולק"ג חלבון מבנות הפר סקורר. בשנת 2003 נאספו דוגמאות לאחוז חלבון מבנות הפר סקורר. מבנות שבעת הפרים הוכנו שתי תערובות אקראיות בכל קצה, כל תערובת בשני העתקים בלתי תלויים. מבנות הפר סקורר הוכנו ארבע תערובות בלתי תלויות לכל קצה, כל תערובת בהעתק יחיד. התערובות שהוכנו משמשות כיום לסריקה שלישית של הכרומוסום לאחוז חלבון. המרווח בין כל אחת מהסריקות, 2.5-3 שנים, קרוב ממוצע החיים היצרניים בעדר הישראלי. לא ידוע לנו על מחקר דומה עם סריקות חוזרות של אותו כרומוסום באותה אוכלוסייה בקצב כזה.

5. בשנת 2003 נאספו דוגמאות חלב מקבוצות קצה לרת"ס ולפוריות נקבית מבנות של שישה פרים. התערובות שהוכנו משמשות לבחינת האפקטים המשניים של האת"כים שכבר נמצאו על הכרומוסום.
תוצאות ודיון
סריקות חוזרות, אללים אבהיים. באיור 1 מוצגות תוצאות מבחני האללים האבהיים בשלוש הסריקות החוזרות של כרומוסום 6 לאחוז חלבון. האפקטים היו מובהקים מאד בכל הסריקות שבוצעו.
איור 1. תוצאות מבחני הסמנים לאללים האבהיים בסריקות החוזרות של כרומוסום 6 לאחוז חלבון.
למראה התוצאות אין כל ספק שהייתה ירידה חדה משנת 1996 לעומת כל הבאות אחריה. לירידה זו יתכנו שני הסברים:

א. יכול להיות שהסריקה הראשונה בלבד כללה במקרה מספר פרים בהם התקיים מצב תאחיזה צמוד (linkage coupling phase) בין אללים חיוביים או שליליים בחלק מהאת"כים בכרומוסום. במצב כזה אללים מוסיפים בשני האת"כים מופיעים על כרומוסום (הפלוטיפ) אחד של הפר, ואללים מפחיתים על הכרומוסום השני (Q1-Q2/q1-q2). בכך יכולים אפקטים בינוניים לכשעצמם של האת"כים השונים בהפלוטיפ להצטבר לאפקטים הקיצוניים שנמצאו. להשערה זאת שני חיזוקים:
• לשני הפרים עם האפקטים הקיצוניים במדגם 1996 (גוליית ותמים) לא נמצא היפוך בכיוון ההשפעות לאורך הכרומוסום כולו (בשני הפרים היה הפלוטיפ אב הפר נפוץ בגבוהות החלבון לכל אורך הכרומוזום). מצב כזה המתאים למצב התאחיזה האמור.
• לא נצפתה ירידה באפקטים באנליזת האללים האימהיים מאיסוף לאיסוף.

ב. מצד שני, בשנות התשעים עבר הטיפוח בישראל מבסיס שומן וחלב לבסיס חלבון בעיקר, ומכאן שאפשר שהירידה באפקטים היא תוצאה של שינוי בשכיחויות האללים החיוביים עקב הסלקציה לאחוז חלבון גבוה בחלב.

בסריקות השונות נמצאו שיאי המובהקות במקומות שונים במקצת זה מזה. כל אחד משיאי המובהקות השונים שנמצאו מתאים לעבודות קודמות. תוצאה זו סבירה בהתחשב במרווח השגיאה הגדול של שיטת המיפוי (20 סנטימורגן). ברור גם שמדובר בכרומוסום עתיר את"כים, וסביר שכל אחד מהסמנים שנבדקו נמצא בתאחיזה עם את"כ אחד לכל הפחות, וקרוב לוודאי שעם יותר. לכל פר קיים מגוון של צירופי גנוטיפים (הומוזיגוט או הטרוזיגוט; שני אללים או יותר) בכל סמן, ומגוון מצבי תאחיזה בין האת"כים (אם יש "רק" שני את"כים, כ"א עם שני אללים, יתכנו ארבעה מצבי תאחיזה בכל הפלוטיפ: QQ, Qq, qQ, qq). האפקט הנצפה הוא תולדה של סך האפקטים כל האת"כים, כפוף למרחק בין האת"כים, למרחק בין הסמנים, להטרוזיגוטיות של כל פר באת"כים ובסמנים שנבדקו, למדגמיות הבנות, ולטעות המדידה. לא נראה מפתיע, אם כך,

באיור 2 מוצגות התוצאות המעודכנות של מדגמי 2002-2003, לכל התכונות שנדגמו.
איור 2. תוצאות מעודכנות של מבחני הסמנים של מדגם 2002-2003.
נמצאה התאמה יפה בין אחוז לק"ג חלבון. כבעבר, האפקטים לאחוז חלבון היו חזקים יותר, אבל הרבה יותר קרובים לאפקטים לק"ג חלבון מאשר התוצאות של מדגם 1996.
תוצאות ראשוניות קרוב למרכז הכרומוסום מצביעות על את"כ בינוני לרת"ס (MSCC). התוצאות מתאימות לעבודות קודמות: במרחק 3 סנטימורגן מהסמן DIK82, דווח בעבר על את"כ המשפיע על דלקות עטין (Klungland et al., 2001).
אללים אימהיים. נבחן פיזור האללים האימהיים ב-15 (1996 ו-1998) או ב-5 (2002-2003) סמנים בתערובות הגבוהות לעומת נמוכות בתכונות אחוז חלבון, ק"ג חלבון, ק"ג חלב, פוריות וסת"ס. תוצאות הסריקות השונות של מבחני תכונה-סמן מוצגות באיור 3.
איור 3. תוצאות מבחני סמן-תכונה, אללים אימהיים.
ספרות

J. G. Kim, T. P. L. Smith, W. M. Snelling, J. L. Vallet, R. K. Christenson. 2003. Linkage mapping of the bovine bone morphogenetic protein receptor-1B (BMPR1B) to chromosome 6. Animal Genetics 34: 311.

Helge Klungland, Ayman Sabry, Bjørg Heringstad, Hanne Gro Olsen, Luis Gomez-Raya, Dag Inge Våge, Ingrid Olsaker, Jørgen Ødegård, Gunnar Klemetsdal, Nina Schulman, Johanna Vilkki, John Ruane, Monica Aasland, Knut Rønningen, Sigbjørn Lien. 2001. Quantitative trait loci affecting clinical mastitis and somatic cell count in dairy cattle. Mamm-Genome 12: 837-842.

Denis M. Larkin, Annelie Everts-van der Wind, Mark Rebeiz, Peter A. Schweitzer, Sharon Bachman, Cheryl Green, Chris L. Wright, Edhilvia J. Campos, Leslie D. Benson, Jennifer Edwards, Lei Liu, Kazutoyo Osoegawa, James E. Womack, Pieter J. de Jong, and Harris A. Lewin. 2003. A Cattle–Human Comparative Map Built with Cattle BAC-Ends and Human Genome Sequence. Genome Res. 13: 1966-1972.

Lipkin, E., Mosig M. O., Darvasi A., Ezra E., Shalom A., Friedmann A., and Soller M. 1998. Quantitative trait locus mapping in dairy cattle by means of selective DNA pooling using milk samples and dinucleotide microsatellite markers: analysis of milk protein percentage. Genetics 149: 1557-1567.

Mathias O. Mosig, Ehud Lipkin, Galina Khutoreskaya, Elena Tchourzyna, Morris Soller and Adam Friedmann. 2001. A Whole genome scan for QTL affecting milk protein percent in Israeli-Holstein cattle, by means of selective milk DNA pooling in a daughter design, using a modified false discovery rate criterion. Genetics 157, 1683-1698.

Micha Ron, David Kliger, Esther Feldmesser, Eyal Seroussi, Ephraim Ezra, and Joel Ira Weller. 2001. Multiple Quantitative Trait Locus Analysis of Bovine Chromosome 6 in the Israeli Holstein Population by a Daughter Design. Genetics 159: 727-735.

Tchourzyna E., Khutoreskaya G., Soller M., Friedmann A. and Lipkin E. 1999. Haplotype identification by single parent cosegregant DNA pools. Proceedings of the conference "From Jay L. Lush to Genomics: Visions for Animal Breeding and Genetics. p. 163.
לכל המבזקים....
office@milk.org.il פקס: 972-3-9564766 טל: 972-3-9564750 דרך החורש 4 , ת"ד 97, יהוד 5647003
מופעל באמצעות מעוף - מגוון אפקט