תקציר:
במחקרים שנעשו בארץ ובחו"ל הוברר כי יצרנות המבכירה בתחלובה הראשונה מושפעת מממשק הגידול של העגלה הצעירה לפני הבגרות המינית. בעבר הוצעו מספר מנגנונים פיזיולוגיים וביוכימיים, אשר הייתה להם השלכה כלכלית מהותית על ממשק הגידול, אולם עד היום לא עמדו מנגנונים אלו במבחן הניסיוני. לאחרונה נערכה במעבדתנו בדיקה אשר עשויה לקדם הבנתנו בנושא זה. עגלות הוגמעו בחלב חופשי (בממוצע 6.5 ק"ג חלב ליום) ונגמלו בגיל 60 יום, והחל מגיל 180 יום ועד גיל 270 יום הוזנו בהתאם ל-NRC (1989) בתוספת 2% חלבון מקמח דגים (חלב-חלבון). תנובת החלב של עגלות אלו בתחלובה ראשונה הייתה גבוהה במידה מובהקת מתנובת עגלות ביקורת אשר גודלו בממשק מקובל של הגמעה בתחליף חלב, ומתנובת עגלות אשר הוגמעו בחלב כנ"ל אולם לא קיבלו תוספת חלבון בהמשך תקופת הגדילה. העגלות מקבוצת החלב-חלבון נבדלו משאר העגלות גם בתכונות אחרות הקשורות למועד כניסה לבגרות מינית, לממדי הגוף ולשינויים במשקל גוף לאחר ההמלטה, אשר תוארו במאמר שפורסם במשק הבקר והחלב (חקר ומעש 25 עמ' 39-50). דגימות עטין נלקחו מהעגלות בגיל 9 חודשים והוכנו לתרבית איבר. התבטאות של חלבוני חלב בעגלות בתולות בתנאי מעבדה, מתקבלת בד"כ בעזרת הורמונים לקטוגנים לאחר אינדוקציה עם הורמוני מין ויותרת הכליה. בעגלות שקיבלו תוספת חלבון במזונן נמצאה התבטאות של RNA לקזאין וביטא לאקטוגלובולין ללא השרייה על ידי פרולקטין. ממצא זה משך את תשומת ליבנו (וחוקרים אחרים). מכיוון שייצור החלב של עגלות אלו בתחלובה ראשונה היה גבוה יתר במידה ניכרת, חשוב היה לברר את המשמעות של התופעה ואת הקשר של אינדוקציה מוקדמת כזו לתנובת החלב בתחלובה הראשונה. במערך הניסוי של הגמעת חלב ותחליף חלב עם אותו ערך קלורי נמצא כי משקל שומן העטין, כליות ומפשעה היו גבוהים יותר בעגלות שהוגמעו חלב, נמצא כי עגלות אלו הניבו יותר חלב בתחלובה ראשונה, ובניסוי אחר מתמשך נמצא כי עגלות שהוזנו בחלב נשארו בעדר עד תחלובה רביעית.
רקע :
בלוטת החלב משמשת ביונקים כמכשיר להזנת הוולד ע"י יצור חלב והפרשתו. התאמת בלוטת החלב לצרכים אלו נעשית עלי ידי גדילה והתמיינות לקראת המלטה והתנוונות לאחר גמילת הצאצאים או לחילופין הפסקת החליבה בבקר. שלושה הורמונים עיקרים חיוניים להתפתחות תקינה של רקמת העטין, פרולקטין, אינסולין וקורטיזול. הורמונים אלו מעורבים בשני השלבים עיקרים בהתפתחות התאים המפרישים בבלוטת החלב, שלב הפרוליפרציה ושלב הדיפרנציאציה. בשלב הפרוליפרציה תאי גזע (stem calls) שבבלוטת החלב מתחלקים לתאים ראשונים (precursors cells) ולתאים מפרישים (secretory cells). שלב הפרוליפרציה מווסת על ידי: אינסולין, epidermal growth factor (EGP) והורמון גדילה (GH). קבוצת הורמונים זו משמשת כגורם מיטוגני. פרולקטין משמש כגורם המעלה את רגישות התאים לאינסולין וכנראה משמש כגורם מיטוגני בעצמו. בשלב הדיפרנציאציה בו מתפתחים התאים המפרישים, יש תפקיד חשוב לקורטיזול בשילוב עם אינסולין ופרולקטין. (3,2). ניתן לגרום להתפתחות בלוטת החלב על ידי מניפולציה בעזרת הורמונים הן בחיה שלמה (בתולה) והן בתרבית איבר של עטין לא ממוין. (4). שימוש בתרבית איבר של עטין עגלות לאחר טיפול תזונתי מאפשר לבחון את השפעת ההגמעה בחלב על התבטאות חלבוני החלב בעטין שלא עבר התמיינות.
מטרות העבודה:
ייצור החלב של הפרה הבוגרת מושפע מממשק ההזנה בתקופת ההגמעה ולאחר מכן עד הבגרות המינית. התבטאות של חלבוני חלב בעגלות בתולות בתנאי מעבדה, מתקבלת בדרך כלל בעזרת הורמונים לקטוגנים לאחר אינדוקציה עם הורמוני מין ויותרת הכליה. בעגלות שקיבלו תוספת חלבון במזונן נמצאה התבטאות של RNA לקזאין וביטא לאקטוגלובולין ללא השרייה על ידי פרולקטין (1). בניסויים שנערכו נבדקה תופעה זו והקשר בין הגמעה בחלב בשלשת החדשים הראשונים לחיי העגלות לבין תנובת החלב של עגלות אילו בתחלובות עוקבות.
מהלך העבודה:
מבנה הניסוי:
20 עגלות בשבוע הראשון לחייהם חולקו ל-2 טיפולים, למשך 60 יום: 1. ביקורת - 10 עגלות הוגמעו בתחליף חלב בצריכה חופשית 2. ניסוי - 10 עגלות הוגמעו בחלב פרה בשתי ארוחות ליום, כאשר בכל ארוחה כמות החלב הייתה חופשית. בתקופת היניקה הייתה לעגלות גישה חופשית למים ולמזון יבש. לאחר הגמילה, בגיל של 80 יום, אוחדו כל העגלות לקבוצה אחת וניזונו במנה אחידה של תערובת בן-אשר ובמנת חולבות לצורך הסתגלות למנת גידול. בגיל 180 יום הועברו כל העגלות למנת גידול, בהתאם להמלצות ה-NRC (1989) ותוספת של 2% חלבון שהורכב מגלוטן וסויה.
לאורך זמן הגידול העגלות נשקלו ונמדדו היקף החזה וגובה המפרקת פעם בשבוע כמו כן נלקח דם לבדיקת רמת הורמונים מטבוליים IGF-I, T3, and Insulin לאחר גמילה [70 יום] העגלות הומתו בהרדמה ונותחו במחלקה הוטרינרית שבבית דגן. האיברים הפנימיים נשקלו ונערכה השוואה בין שתי הדיאטות. עם הכניסה לבגרות מינית ( גיל 8-9 חודשים) 6 עגלות 3 מכל טיפול נשחטות בבית המטבחיים איברים פנימיים הוערכו ובלוטות החלב הובאו למעבדה באופן סטרילי לתרבית איבר.
שיטות
הכנת תרבית איבר : בלוטות החלב הוסרו מתחת לעור באופן סטרילי והובאו למעבדה בתוך מדיום 199-M שהכיל אנטיביוטיקה. הרקמה נחתכה לפיסות של 5-8 מ"ג, נשטפה מספר פעמים במדיום, והונחה על גבי נייר עדשות שעבר אמפרגנציה בסיליקון וצף על פני המדיום בצלחת פטרי מאווררת. הצלחות עם השתלים הוכנסו לאינקובאטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלסיוס ובאווירה של אוויר: CO2 ביחס של 5:95. המדיום שבצלחת הכיל אינסולין (I) וקורטיזול (F) עם או בלי פרולקטין (P). המדיום הוחלף כל 24 שעות. לאחר תקופת האינקובציה נבדקו המדדים הבאים:
1.התבטאות mRNA של חלבוני החלב casein ו- lactoglobulin- ß .
2. סינתזת קזאין על ידי השתלים.
בידוד RNA: בגמר כול ניסוי הופק RNA מהשתלים. RNA כללי הופק תוך שימוש בערכת Tri-Reagent (RNA/DNA/Protein isolation reagent) בהתאם להוראות היצרן.
: Reverse Transcriptase הוכן מ 1 g של RNA כללי שהופק מרקמות המטרה על ידי הדגרה עם אנזים AMV Reverse transcriptase של חברת Promega עם בופר שסופק עם האנזים (Reverse Transcription Buffer), 0.5mM dNTP’s, 0.5 mM oligo (dT) 15 primmer, בנפח סופי של μl 20 למשך 60 דקות בטמפ' של 420C. תוצרי הRT-PCR נמהלו ל μl 100.
Real time PCR: הפריימרים ששמשו לתהליך סונתזו על ידי חברת MBC. נוסחאות החישוב לתוצאות :
1. חושב ממוצע ה Ct (Ct-מס' מחזורי ההגברה עד להתחלת השלב הליניארי של ה-PCR). לכל טיפול היו 3 חזרות .
2. יחוס רמת הביטוי של הגן הנבדק מול רמת הביטוי של 18S :
ΔCt=Ct house keeping gene- Ct examinee gen
3. יחוס רמת הביטוי של הגן הנבדק ביחס לרקמת טיפול המקור-
ΔΔCt=ΔCtifp-n- ΔCtif(n- קבוצות הטיפול)
4. תרגום תוצאות Ct לרמת ביטוי- 2-ΔΔCt .
תוצאות
תמונה 1 : התבטאות של בטא-לקטוגלובולין ואלפא-קזאין בתרבית אבר של עטין מעגלה בת 8 חודשים לאחר טיפול הורמונאלי שכלל אינסולין והידרקורורטיזול (IF) או אינסולין והידרוקוטיזול ופרולקטין (IFP). רמת הביטוי של mRNA של 18S, בטא-לקטוגלובולין ואלפא-קזאין בעטין של עגלות מיד לאחר השחיטה (1-4) ובתרביות אבר של עטין שנאסף לאחר השחיטה מעגלות בקבוצות הטיפול השונות (5-12), והוחזק במדיום שהכיל אינסולין (I), הידרוקוטיזול (F) ופרולקטין (P). כאשר בחנו את הביטוי של שני חלבוני החלב העיקרים אלפא קזאין ובטא לאקטוגלובולין, ראינו כי בעגלות שהוחזקו במשטר הזנה במשך 60 ימי הגידול הראשונים על בסיס חלב ניתן היה למצוא ביטוי של חלבוני החלב העיקרים עם ובלי השראה של פרולקטין (קבוצה 3, 4). בעגלות 1, 2 ישנו ביטוי חלש של חלבוני החלב רק לאחר חשיפה של השתלים שנאספו מבלוטת החלב לפרולקטין. ממצאים אלו מצבאים על בשלות של בלוטת החלב בקרב עגלות שהוזנו בחלב פרה במהלך 60 הימים הראשונים בהשוואה לאלה שהוזנו בתחליף חלב.
טבלה 1 : משקל (גר') של רקמת השומן הפריפריאלי סביב רקמות שונות, ואזורים שונים לאחר משטרי ההזנה שונים. מהנתונים המוצגים ניתן לראות כי בכול מאגרי השומן שנבדקו, מסת רקמת השומן בקרב עגלות שהוחזקו במשטר הזנה על בסיס חלב הייתה גבוהה יותר.
גרף 1: התבטאות mRNA של בטא-לאקטוגלובולין ברקמת העטין במשטרי הזנה שונים (חלב, ותחליף חלב) ביום השחיטה , בתרבית בנוכחות של אינסולין ובתרבית שהוחזקה בנוכחות פרולקטין ואינסולין . כאשר בחנו את רגישות בלוטת החלב לפרולקטין בשתלים של בלוטת חלב שנאספו קבוצות הטיפול השונות, ראינו כי רמת הביטוי של בטא-לאקטוגלובולין בשתלים של בלוטת חלב של עגלות שהוחזקו במשטר הזנה על בסיס חלב הייתה גבוהה יותר בתגובה לפרולקטין בהשוואה לשתלים של עגלות שהוזנו בתחליף חלב ב 60 הימים הראשונים.
גרף 2: רמות ההורמונים המטבוליים שנמדדו בעגלות מקבוצות הטיפול השונות שגודלו במשטר הזנה על בסיס חלב או תחליף חלב (ביקורת). מתוצאות הבדיקות עולה כי רמות ההורמונים T3 וIGF-1 היו גבוהות יותר בקבוצת הטיפול שגודלו במשטר הזנה על בסיס חלב, ואילו רמות האינסולין בשתי קבוצות הניסוי לא היו שונות באופן מובהק.
טבלה 2: מסת רקמת השומן (גרמים) בגמר הניסוי בעגלות סביב הכליה ובבלוטת החלב (ת-תחליף, ח-חלב). כאשר השוונו את מסת רקמת השומן בעטין ובסיס הכליה ניתן לראות כי בעגלות שהוחזקו במשטר הזנה על בסיס חלב במהלך 60 הימים הראשונים הייתה הצטברות גדולה יותר של רקמת שומן באותם אברים.
טבלה 3: נתוני תחלובה של הפרות מקבוצות הטיפול השונות במהלך התחלובה השנייה והשלישית (ליטר חלב ביום). מקרא: אבקת חלב:ביקורת – 60 יום ראשונים אבקת חלב ולאחר מכן המנה המומלצת, אבקת חלב:חלבון - 60 יום ראשונים אבקת חלב ולאחר מכן המנה המומלצת בתוספת של 2 אחוז חלבון. חלב:ביקורת - 60 יום ראשונים חלב ולאחר מכן המנה המומלצת, חלב:חלבון - 60 יום ראשונים חלב ולאחר מכן המנה המומלצת בתוספת של 2 אחוז חלבון. סימון בעל אות שונה משמעו הבדל מובהק בין הקבוצות (p>0.05). כאשר השוונו את תנובת החלב היומית של פרות מקבוצות הטיפול השונות במהלך תקופת התחלובה השנייה והשלישית, ראינו כי הפרות שהוחזקו כעגלות במשטר הזנה על בסיס חלב ולאחר מכן קיבלו את משטר הזנה המומלץ בתוספת של 2 אחוז חלבון, רמת התנובה הייתה גבוהה יותר באופן מובהק משאר קבוצות הטיפול.
תמונה 2: חתכים היסטולוגים של עטין מעגלה בת 8 חודשים. A - חתך היסטולוגי בעגלה שהוחזקה במשטר הזנה על בסיס חלב. B – חתך היסטולוגי בעגלה שהוחזקה במשטר הזנה על בסיס תחליף חלב. בחתך A ניתן לראות הנצה ראשונית של בלוטת החלב, בניגוד למה שניתן לראות בחתך B. ממצא זה מרמז על "הבשלה" מוקדמת של בלוטת החלב בקרב עגלות שהוחזקו במשטר הזנה על בסיס חלב בהשוואה לעגלות שהוזנו בתחליף חלב במשך 60 ימי הגידול הראשונים.
מסקנות:
כאשר בוחנים את התוצאות המתקבלות מנתוני התחלובה של הפרות שהשתתפו בניסוי זה (טבלה 3), עולה כי ישנו קשר ישיר בין משטר ההזנה במהלך תקופת גידול העגלות לביצועי התחלובה בשלב הבוגר של הפרה החולבת. כפי שניתן לראות בטבלה 1 ו טבלה 2, ניתן לראות כי כאשר עגלות הוזנו במהלך 60 הימים הראשונים בחלב, רקמת השומן באברים הפריפריאליים בכלל וברקמת שומן העטין בפרט הייתה גדולה יותר בהשוואה לזו שנצפתה בעגלות שהוזנו בתחליף חלב. בנוסף ניתן לראות כי העגלות שהוזנו בחלב במהלך 60 הימים הראשונים ולאחר מכן המנה הועשרה ב 2 אחוז חלבון, רמת התחלובה שנמדדה הייתה הגבוהה יותר, החל מהתחלובה הראשונה ועד התחלובה השלישית. נתונים אלו מרמזים על חשיבות רקמת השומן שנצברת במהלך השלב הראשוני של הגדילה לשלבי התחלובה במהלך החיים היצרנים של הפרה החולבת (טבלה 3). כיום ידוע כי מספר תאי השומן בגוף בעל החיים נקבע בשלבים הראשונים של הגדילה, לאחר מכן ההבדלים במסת רקמת השומן נובעים מגודל התאים ולא משינוים במספרם. על בסיס עובדה זו יש בסיס להנחה כי מתן משטר הזנה התומך בגידול תאי השומן בשלבי הגידול הראשוניים, יאפשר בהמשך לבלוטת החלב לממש את הפוטנציאל הלקטוגני שלה. כלומר הזנה בחלב חופשי בשלבים הראשונים יובילו לגדילה מספר תאי השומן (כפי שמבוטא בטבלה 1), בהמשך משטר הזנה מועשר (במקרה זה תוספת של 2 אחוז חלבון למנה המומלצת היום) הוביל ליוצרות של רקמת שומן תומכת תחלובה. העובדה כי תוספת של חלבון למנה של פרות שקיבלו בשלבי הינקות תחליף חלב ולא חלב, לא השפיע על מדדי התחלובה מחזקת את הנחה הזו. חיזוק נוסף להנחה כי רקמת השומן מהווה גורם המעורב בויסות הפוטנציאל הלקטוגני של בלוטת החלב ניתן למצוא בעבודה אחרת שנערכה במעבדתי בה בחנו באמצעים מולקולרים את אופי האינטראקציה בין רקמת השומן והיחידה האלבאולרית בבלוטת החלב (Feuermann et al, 2006, Feuermann et al, 2004). מתוצאות עבודה זו עלה כי גורמים שונים המופרשים מרקמת השומן ומיצגים למעשה את גודלה, מעורבים בויסות הפוטנציאל הלקטוגני של בלוטת החלב בבקר (לדוגמא לפטין). מדדים נוספים אשר מצביעים על חשיבות משטר ההזנה בשלבי הגידול הראשוניים על התפתחות מכסימלית של בלוטת החלב ניתן לראות בתמונה 1, בניסוי המוצג בתמונה 1 נבחנו רמות הביטוי של חלבוני החלב בטא-לאקטוגלובולין ואלפא-קזאין. לאחר השחיטה של העגלות, שתלים של העטין מקבוצות הניסוי השונות נאספו והוחזקו במדיום שהכיל אינסולין, הידרוקוטיזול או אינסולין, הידרוקוטיזול ואת חלבון החלב – פרולקטין. מתוצאות הניסוי עולה כי עגלות שמשטר ההזנה שלהם היה חלב, בלוטת החלב שלהן "הבשילה" מוקדם יותר והגיבה להורמון החלב- פרולקטין. בנוסף בגרף 1 ניתן לראות את התגובה ברמת הביטוי של חלבוני בשתלים של רקמת עטין שנאספו מעגלות שהוזנו בחלב לפרולקטין הייתה גבוהה יותר בהשוואה לעטינים של עגלות שהוזנו בתחליף חלב. ממצא המרמז על ההשפעה שיש למשטר הזנה המבוסס על חלב פרה על התבגרות מוקדמת (ביחס למשטרי ההזנה על בסיס תחליף חלב) של בלוטת החלב. עובדה נוספת המרמזת על הבשלה מוקדמת של בלוטת החלב בקרב עגלות שהוחזקו במשטר הזנה על בסיס חלב, ניתן לראות בבדיקות ההיסטולוגיות של בלוטת החלב. כפי שרואים בתמונה 2, ניתן להבחין בהנצה ראשונית של היחידות האלבואורליות בבלוטת החלב של העגלות שהוחזקו במשטר הזנה שכלל חלב פרה.
ממצא נוסף היכול לרמז על ההשפעה החיובית של משטר הזנה על בסיס חלב להתפתחות של בלוטת החלב ניתן לראות בתוצאות העולות מבדיקת רמות ההורמונים בדם העגלות בקבוצות השונות.
ההורמונים שנבדקו הם:
• Triiodothyronine) T3 ) השיך להורמונים התירואיד, הורמונים אלו חיוניים ללקטציה ולהפרשה מכסימלית של חלב בחיה השלמה. הורמוני התירואיד ממלאים תפקיד חשוב בדיפרנציאציה של הבלוטה ובזירוז פעילות מטבולית כללית.
• אינסולין- חיוני לקיום התאים האלבאולרית בעטין. משתתף בחלוקת מטבוליטים בין יצור חלב לרקמות הגוף. בנוכחות של קורטיזול ופרולקטין אינסולין גורם לעליה ברמת ה mRNA לקזאין בתאי האפיתל וליצירת קזאין. אינסולין דרוש גם לצורך סינתזה של לקטוז ושומן החלב.
• insulin-like growth factor- IGF-1 מהווה גורם גדילה חשוב. עליה ברמת IGF-1 לרוב מיוחסת לפעילות אנבולית מוגברת.
מתוצאות הבדיקה עולה כי רמות ה - T3 וה- IGF-1 היו גבוהות בקבוצה שניזונה מחלב בהשוואה לזו שניזונה מתחליף חלב במהלך 60 ימי הגידול הראשונים.
מכאן נובע כי : לממשק ההזנה במהלך 60 הימים הראשונים יש חשובות מכרעת בויסות פוטנציאל התחלובה של בלוטת החלב בבקר. ברור כי ממשק ההזנה המתאים ביותר להיווצרותה של בלוטת חלב ורקמת שומן תומכת תחלובה, הוא הזנה בחלב פרה ("חלב אם"). חלב הפרה בניגוד לתחליפי החלב המסחריים מכיל גורמים תזונתיים וההורמונלים נוספים, שאינם יכולים להיות מבוטאים בערך קלורי בלבד. ככול הנראה, למרכיבים אלו חשיבות מכרעת בויסות התפתחות בלוטת-החלב בשלבים הראשונים ובהמשך מהווים בסיס לפוטנציאל לקטוגני גבוה המבוטא ברמת התחלובות עוקבות. שילוב של עבודות אחרות שנערכו במעבדתי במהלך התקופה האחרונה, בהן הודגמה חשיבותה של רקמת שומן לויסות הפוטנציאל הלקטוגני של בלוטת החלב בשילוב אם עבודות חדשניות שפורסמו במהלך השנתיים אחרונות בהן הודגשה חשיבותה של רקמת השומן האבר אנדוקריני פעיל בעל חשיבות דגולה בויסות המאזן האנרגטי של בעל החיים ממחיש את חשיבותה של רקמת השומן בעטין להתפתחות בלוטות החלב. מהממצאים העולים מעבודה זו ומעבודות נוספות בהם נבחנה השפעתה של רקמת השומן על בלוטת החלב,ו הובילו אותנו למסקנה כי ממשק הגידול במהלך 60 הימים הראשונים של העגלה מהווה בסיס לבניה של רקמת שומן תומכת תחלובה. ממצאים עדכניים של מחקרים חדשים שנערכו הן על ידנו והן על ידי קבוצות מחקר מובילות בתחום מעלי הגרה (דוגמת קבוצת המחקר של קפוקו מהUSDA-, (Connor et al,2006)) ממחישים את חשיבותה של רקמת השומן בבלוטת החלב בבקר בכלל ואת חשיבותו של משטר הזנה תומך בעגלות בפרט כגורם המעורב בויסות תהליכי התפתחות ברמה האנדוקרינית והפיזיולוגית.
רשימת ספרות:
1. א. שמאי, ד. ורנר, ע. מועלם, ש. יעקובי, פ. לנדמן, ח. לרר, מ. ניקבח, י. ברוקנטל, ח. ברש. (2003). מימשק גידול עגלות תחלופה, למיצוי פוטנציאל הייצור של פרות חלב. משק הבקר והחלב (חקר ומעש)25:39-51
