דוח סופי לתכנית מחקר מספר 362-0210-08


מיפוי עדין ואפיון הגן הכמותי להתעברות על כרומוסום מספר 7 בבקר


מוגש להנהלת ענף בקר
ע"י
מיכה רון מכון בע"ח, מינהל המחקר החקלאי
קאים משה מכון בע"ח, מינהל המחקר החקלאי
וולפנזון דוד מכון לחקר בע"ח, הפקולטה לחקלאות
עזרא אפרים התאחדות מגדלי בקר
יהודה ולר מכון בע"ח, מינהל המחקר החקלאי

 


2.1.1 תקציר
הצגת הבעיה: בשנות ה-90 הכנו תשתית של 11 משפחות בתי-אב עם כ-1000 בנות לפר המאפשרת חיפוש רב-עוצמה של גנים כמותיים. סרקנו את הגנום לקיום אתרים המשפיעים על תכונות כמותיות. מצאנו אתר מתפצל לשיעור התעברות באוכלוסיית בקר הולשטיין-ישראלי בכרומוסום 7.


מטרות המחקר:

לבצע מיפוי עדין יותר של האזור ע"י קביעת גנוטיפים עבור סמנים נוספים, ולאתר את הפולימורפיזם הספציפי בגן האחראי לפוריות נקבית.


שיטות ומהלך העבודה:

נשלחו מעטפות למשקים לאיסוף דוגמאות של תאי בושת של פרות בנות 5 פרים בעזרת מברשות דגימה. הרפתנים אספו את דוגמאות התאים ושלחו לנו בדואר. נאספו 2436 דוגמאות דנא על ידי מברשות ואגינליות מ-74 משקים קיבוציים. QTL המשפיע על פוריות נקבית (אחד חלקי מספר ההזרעות להתעברות) נמצא בקצה הצנטרומרי במירווח של 0 עד 27 יחידות מפה על כרומוזום 7. 5 מתוך 10 משפחות בתי-אב באוכלוסיה הישראלית שנבדקו נמצאו הטרוזיגוטיות ל-QTL. נבדקו 287 סמני SNP על מחצית כרומוסום 7, הקרובה לצנטרומר, ל-380 עד 650 פרים. כמו כן נבדקו 704 סמנים ל-910 פרים באמצעות השבב של אילומינה. רק סמן יחיד NGS-58879 נמצא מתאים במבחן התאמה (Concordance) כלומר היה הטרוזיגוט ל-5 הפרים ההטרוזיגוטים ל-QTL והומוזיגוט ליתרת הפרים. לסמן זה נמצאה השפעה מובהקת של 1% לפוריות במדגם של 910 פרים שנבדקו באמצעות השבב של אילומינה (0.00001). מדגמים של בנות ל-5 הפרים ההטרוזיגוטים נבדקו לגבי הפלוטיפ הסמן עם ה-QTL. נמצא הפלוטיפ אחיד ב-4 הפרים מתוך 5. לפיכך נמצאה התאמה ב-9 מתוך 10 פרים. שונות במספר עותקים (CNV) נמצאה בגן KIAA1683 הנמצא בקרבת NGS-58879. לפר ההטרוזיגוט שהראה קשר הפוך עם ה-QTL היה צירוף ייחודי של CNV.


תוצאות עיקריות:

נמצאה השפעה על פוריות במירווח של 0 עד 27 יחידות מפה על כרומוזום 7. נמצא סמן עם 90% התאמה ל-QTL ונמצאה שונות מסוג CNV בגן KIAA1683 העשוי להיות אחראי ל-QTL.


מסקנות והמלצות לגבי יישום התוצאות:

איתור עתידי של הגן ילווה בשמירת זכויות על ידי פטנט.


1. מבוא ותיאור הבעיה
(2004) Arias and Kirkpatrick ו- Cruickshank et al. (2004)מצאו בבקר אתר המשפיע על השכיחות של אירועי ביוץ כפול ושל המלטות תאומים, ליד הצנטרומר של כרומוסום 7. בשנות ה-90 הכנו תשתית של 11 משפחות בתי-אב עם כ-1000 בנות לפר המאפשרת חיפוש רב-עוצמה של גנים כמותיים. סרקנו את הגנום לקיום אתרים המשפיעים על תכונות כמותיות. מצאנו אתר מתפצל לשיעור התעברות באוכלוסית בקר הולשטיין-ישראלי בכרומוסום 7, במיקום של כ-15 יחידות מפה מהצנטרומר (איור 1). נמצאה עדות לקיום גן מתפצל המשפיע על אחוז התעברות בבנות הפרים בוטח ומפי (p<.0001). ההפרש בערך הגנטי בין פרטים הומוזיגוטים שונים לגן, הוא כ-4 אחוז התעברות השקולים ל-2 סטיות תקן גנטיות. קבוצות הפרות עם שיעור התעברות גבוה אופיינו בשיעור תאומים גבוה יותר. השפעה זו היתה עקבית בכל התחלובות אך מובהקת רק בתחלובה שניה. מיקום האתר המשפיע על שיעור התעברות נמצא זהה במחקרנו לזה של (2004) Arias and Kirkpatrick. התוצאות הוצגו בכנס הבקר בארץ ובכנס העולמי לגנטיקה של בעלי-חיים חקלאיים בברזיל (Weller et al., 2006) ובסקוטלנד (Glick et al., 2010). בשנים האחרונות הצטבר מידע בארץ ובחו"ל, ששיעור ההתעברות של פרות שהוזרעו בעקבות ביוץ כפול, גבוה יותר בהשוואה לפרות שהוזרעו בעקבות ביוץ יחיד. מכיון ששיעור הביוצים הכפולים עשוי להשפיע על שיעור ההתעברות ייתכן ואותו הגן נמצא בשני המחקרים.


איור 1: מיפוי ה-QTL בכרומוסום 7 בבקר

 

 


2. מיפוי עדין ואפיון הגן הכמותי להתעברות על כרומוסום מספר 7 בבקר


2.1 מטרות המחקר
לבצע מיפוי עדין יותר של האזור ע"י קביעת גנוטיפים עבור סמנים נוספים, ולאתר את הפולימורפיזם הספציפי בגן האחראי להשפעה על פוריות נקבית ולאמוד את שכיחות האלל המעלה פוריות.


2.2 חשיבות המחקר
האלל החיובי, המעלה שיעור התעברות, הוא האלל הנדיר יותר, ונמצא בתדירות של כ-10% באוכלוסיה הישראלית. לכן, האופק לסלקציה הוא רב, וכך גם הפוטנציאל לפטנט ולמימוש מסחרי של התגלית בעולם.


פירוט עיקרי הניסויים
שלחנו מעטפות למשקים לאיסוף דוגמאות של תאי בושת בעזרת מברשת דגימה (איור 2). המטרה הייתה לאסוף כ-600 דוגמאות של פרות חיות לכל אחד מחמשת הפרים. הרפתנים אספו את דוגמאות התאים ושלחו לנו בדואר. נאספו 2436 דוגמאות מתוך 3000 המתוכננות. במקביל בוצעה הפקת דנא רובוטית של הדוגמאות, בפורמט של צלחת המכילה 96 מקומות (איור 3), ובוצעה בדיקה של סמנים גנטיים אשר העידה שאיכות ה-דנא המתקבלת היא תקינה. המדגם מיועד לבדיקת משפחות הפרים לגבי התפצלות הגן לפוריות. כמו כן, ניתן יהיה בעתיד לבדוק את שיעור הביוצים בקבוצת פרות חיות, בנות פר מתפצל, שנושאות את האלל המעלה לגן לפוריות לעומת אלו שנושאות את האלל המוריד פוריות.


איור 2: הוצאת מטוש לקראת הפקת דנא

 


איור 3: הפקת דנא ממטושים ואגינליים בצלחת של 96 דוגמאות

 


פותחו 287 סמנים מסוג Single Nucleotide Polymorphism (SNP) בכרומוסום מס' 7. הם נבדקו על דנ"א של 350 עד 670 פרים ישראלים לבחינת אי-שיווי משקל תאחיזתי עם הגן המשפיע על פוריות.


כל סמן נותח לבד עבור פוריות נקבית. גודל ומובהקות ההשפעות על התכונות הכמותיות נקבעות לפי המודל הקווי הבא:
BVi = S + BY + BY2 + ei


כאשר:
BVi = אומדן התורשה של הפר i,
S = הגנוטיפ של הפר לסמן, כאשר להטרוזיגוט יש ערך 1, ולשני ההומוזיגוטים ערכים של 0 ו-2,
BY = שנת הלידה של הפר,
ei = השארית הלא מוסברת.


באיור 4 ניתן לראות את התפלגות הגנוטיפים של 25 סמני SNP (באדום דוגמאות שלא הצליחו, הטרוזיגוטים בצהוב והומוזיגוטים בצבעים אחרים). איכות קביעת הגנוטיפ בכל נקודה מאופיינת בצבע: ירוק מאפיין קביעה בטוחה conservative.


איור 4: מידע המתקבל מבדיקת סמני SNP על ידי מכשיר מסוג Maldi-TOF

 


בנוסף, הופעל שבב של חברת אילומינה הכולל 704 סמנים לבדיקת 910 פרים ישראלים. גנוטיפ הסמנים נבדק עבור 5 בתי-אב מתפצלים ל-QTL ויתרת 5 פרים לא מתפצלים. רק סמן יחיד NGS-58879 עמד במבחן התאמה (Concordance) כלומר היה הטרוזיגוט ל-5 הפרים ההטרוזיגוטים ל-QTL והומוזיגוט ליתרת הפרים.
לסמן NGS-58879 נמצאה השפעה מובהקת של 1% לפוריות במדגם של 910 פרים שנבדקו באמצעות השבב של אילומינה (0.00001).


מדגמים של בנות ל-5 הפרים ההטרוזיגוטים נבדקו לגבי הפלוטיפ הסמן עם ה-QTL. נמצא הפלוטיפ אחיד ב-4 הפרים מתוך 5. לפיכך נמצאה התאמה ב-9 מתוך 10 פרים. שונות במספר עותקים (CNV) נמצאה בגן KIAA1683 הנמצא בקרבת NGS-58879. לפרים הומוזיגוטים לאלל A בסמן היו שני סוגים, בעוד שלפרים ההטרוזיגוטים היו 3 או 4 סוגים. לפר ההטרוזיגוט שהראה קשר הפוך עם ה-QTL היה צירוף ייחודי של CNV.


המשך המחקר
נדרשת בדיקה נוספת של הקשר בין שונות במספר עותקים בגן KIAA1683 לגן המשפיע על פוריות. כמו כן, ניתן יהיה בעתיד לבדוק את שיעור הביוצים בקבוצת פרות חיות, בנות פר מתפצל, שנושאות את האלל המעלה לגן לפוריות לעומת אלו שנושאות את האלל המוריד פוריות.


רשימת פרסומים


Weller J. I., Golik M., Seroussi E., Ron M., and Ezra E. (2008) Detection of quantitative trait loci affecting twinning rate in Israeli Holsteins by the daughter design. J. Dairy Sci. 91(6): 2469-74.
Weller, J. I., Golik, M., Reikhav, S., Domochovsky, R., Seroussi, E., and Ron, M. (2008) Detection and analysis of QTL affecting production and secondary traits on chromosome 7 in Israeli Holsteins. J. Dairy Sci. 91: 802-813.
Glick G., Shiraq A., Seroussi E., Zeron J., Ezra E., Weller J.I. and Ron M. (2010) Association between copy number variation and fertility QTL on BTA7 in Israeli Holstein dairy cattle. 32nd International Society of Animal Genetics (Edinbourgh, UK).

 

 

3. סיכום עם שאלות מנחות

 

לכל המבזקים....
office@milk.org.il פקס: 972-3-9564766 טל: 972-3-9564750 דרך החורש 4 , ת"ד 97, יהוד 5647003
מופעל באמצעות מעוף - מגוון אפקט