הצעת מחקר: השפעת הזנת פרות בתקופת המעבר על משק האנרגיה והביצועים


דוח סופי להצעת מחקר להנהלת ענף בקר (820-0171-06)


מאת ע. אריאלי, וע. מועלם הפקולטה לחקלאות ומנהל המחקר החקלאי


תקציר
נבחנה התרומה של מקורות אנרגיה שונים על משק האנרגיה בעגלות המצוידות בפיסטולה בכרס המוחזקות במאזן אנרגיה שלילי. נבדק הקשר בין סוג המטאבוליטים הנספג במערכת העיכול לשינויים במטאבוליזם דופן הכרס, והקשר בין שינויים אלו ומצבן האנרגטי של פרות בתקופת המעבר. נבחנה השפעת הרכב הפחמימות במנה על מבנה ותפקוד פטמיות בכרס. המנות היו ביקורת (מנת יבשות מדוללת בקש), ו3 מנות אנרגטיות: תוספת עמילן פריק כרס (שעורה), תוספת סיב פריק בכרס (קליפות סויה) ותוספת עמילן שרידי כרס (תירס). נמדדה נעכלות נוטריינטים כללית, בכרס ובמעי, ערכי מטאבוליטים בכרס ובדם. ביופסיות דופן הכרס נבחנו היסטולוגית (ממדי פטמיות ואחוז תאים מתחלקים) ומטאבולית (ביטוי mRNA לאנזימי מפתח בניצול חומצות שומן נדיפות). האנרגיה המטבולית הנצרכת היתה נמוכה במנת הביקורת ממנת העמילן השרידי והסיב הפריק. ריכוזי NEFA וPUN  בפלסמה במנת הביקורת היו גבוהים, ונמוכים ביותר במנת העמילן השרידי. רמת הביטוי של Acetyl-CoA Synthase בתחילת הסבב נטו להיות נמוכים בביקורת, לעומת העמילן השרידי. רמת הביטוי של Propionyl-CoA Carboxilase בתחילת הסבב, היתה גבוהה בעמילן שרידי בהשוואה לסיב פריק. מניתוח התוצאות עולה כי עגלות מתאימות לשמש מודל להערכת השפעות מזון במאזן אנרגיה שלילי על פרת המעבר. נראה שהבקרה על מורפולוגיה והמטבוליזם בדופן הכרס מושפעת מרמת מטבוליטים והורמונים בדם ולא רק בנוזל הכרס. ממגוון התוצאות שהושגו בעבודה זו ניתן להסיק כי התוספת הפחמימנית המומלצת לפרות לקראת המלטה היא תוספת עמילן שרידי.


מבוא

במהלך תקופת המעבר הקצרה על פרת החלב להתאים את המטבוליזם למעבר חד מרמת הזנה נמוכה של פרה יבשה לרמת הזנה התואמת הנבה מלאה. בשל מגבלות מטבוליות סמוך להמלטה נמוכה יחסית צריכת המזון והאנרגיה של הפרות וכתוצאה מכך הן מצויות במאזן אנרגיה שלילי. גרעון האנרגיה מכוסה ע"י גיוס רזרבות גופניות. כאשר גירעון האנרגיה גבוה מדי הגיוס המוגבר מלווה בהפרעות מטבוליות הפוגעות בבריאות הפרה, בפוריותה ובכושר הנבתה. שכיחות ההפרעות המטבוליות בפרות חלב בתקופת המעבר גברה בשנים האחרונות במקביל לעליית התנובה. הועלו מספר הצעות לצמצם באמצעות תזונה מתאימה את נזקי ההפרעות המטבוליות. בעבודה קודמת מצאנו כי הוספת מוננזין לפרות בתקופת המעבר הפחיתה את רמת חומצות השומן החופשיות בפלסמה לאחר ההמלטה. הסבר אפשרי הוא שהעלאת אספקת הגלוקוז לפני ההמלטה מקטינה את שינוע הרזרבות השומניות בגוף הפרה. מאידך קיימת אי בהירות ביחס לשאלה האם עדיף לשפר את אספקת הפחמימות הפריקות בכרס או לספק פחמימות זמינות עוקפות כרס. כן קיימת אי בהירות בספרות לגבי השאלה מה מידת החשיבות של מצב ההתפתחות של פיטמיות הכרס על סך הספיגה של החומצות השומן הנדיפות מהכרס. שאלות אלו נבחנו בעבודה הנוכחית.

 

מטרות המחקר
מחקר זה בחן את התרומה של הגברת אספקת מקורות אנרגיה שונים על משק האנרגיה בפרות בתקופת המעבר.
נבדק הקשר בין סוג המטאבוליטים הנספג לשינויים בהרכב דופן הכרס, ובאיזה מידה יש לשינויים אלו השפעה על מצבן האנרגטי של פרות בתקופת המעבר. 

 

רקע מדעי 
תקופת המעבר בפרות חלב מוגדרת כתקופה הכוללת את שלושת השבועות האחרונים ביובש ואת שלושת השבועות הראשונים לאחר ההמלטה. תקופה זו מאופיינת בשכיחות גבוהה של הפרעות מטאבוליות הקשורה בשינויים במשק האנרגיה בפרה ((Mallard et al., 1998. בתקופה זו אספקת האנרגיה נמוכה מהדרישות הפיזיולוגיות לקיום, גידול עובר וחלב ((Bell, 1995. צריכת המזון מספר שבועות לפני ההמלטה עשויה לרדת בכ 30% Bertics et al., 1992)). לכיסוי גרעון האנרגיה מגייסת הפרה רזרבות גופניות שמרביתן שומן אך קיים גם גיוס חלבון. קיים קשר מוכח בין הפרעות מטבוליות כגון קטוזיס לבין עלית רמת חומצות שומן חופשיות בדם בסמוך להמלטה ((Grummer, 1993. חלק נכבד מצרכי האנרגיה מסופק באמצעות גלוקוז הנוצר בכבד מפרופיונט (Greenfield et., 2000). בתנאים אלה ניתן לצפות כי הגברת אספקת הגלוקוז תסייע לצמצום שינוע שומן בפרת המעבר.
קיימים שני מסלולים אפשריים לשיפור אספקת הגלוקוז לפרה. מסלול אחד הינו באמצעות הגברת התסיסה בכרס. למסלול זה יתרון נוסף בשל ההשפעה החיובית שיש לנוכחות חומצות שומן נדיפות על גדילת בלוטיות הכרס (et al., 1997 Dirksen) וצמצום משך הזמן הדרוש לשם השלמת האדפטציה למנת פרות חולבות מרוכזת. מאידך קיים קושי להגביר בצורה ניכרת את אספקת הפחמימות הזמינות לכרס בפרות יבשות מאחר והדבר עשויה לגרום לאצידוזיס או להשמנה. ניתן להשפיע על אופי התסיסה בכרס באמצעות היונופור מוננזין המגדיל את חלקה היחסי של חומצה פרופיונית בכרס  (Van Nevel 1991). מתן מוננזין לפני המלטה הוריד את רמת חומצות השומן החופשיות וגופי קטו בתקופת היובש (Stephenson et al., 1997), לאחר ההמלטה  (Duffield et al., 1998), ואף העלה תנובת חלב (Duffield et al., 1999). ניסוי שערכנו במשק ניר גלים (Arieli et al., 2008) הראה כי גם בתנאי המשק הישראלי יצור חלב בפרות שקיבלו מוננזין בתקופת היובש עלה בכ 3 ק"ג.
אפשרות חילופית לשיפור אספקת האנרגיה היא להגביר את אספקת העמילן עוקף כרס במנה. יש לזכור שההמלצות המקובלות ((NRC, 1989 הן שפרות לא יעלו במשקל בתקופת היובש (פרט לשינויים הקשורים בתוספת רקמות לעובר). כדי למנוע שינויים חריפים במצב הגופני יש לאזן בצורה מדויקת את האנרגיה הנוספת. בניסוי שבחן השפעת תוספת גרעיני תירס לפרות ביובש (ריכוזיות אנרגיה 1.44 במקום  1.27 מגקלוריה לק"ג ח"י) נמצא כי תוספת האנרגיה הפחמימנית לא לוותה בשינויים ברמות המטבוליטים בדם (Grum et al., 1996). בניסוי אחר בו הועלתה ריכוזיות האנרגיה מ 1.34 בביקורת ל 1.63 מגקלוריה לק"ג ח"י באמצעות הוספת גרעיני תירס למנה במשך 19 ימים לפני המלטה נמצא שיפור ניכר בצריכת החומר היבש ובמאזן האנרגיה של הפרות לפני ההמלטה (Minor et al., 1998). שינויים אלו לוו בירידת רמת חומצות שומן חופשיות בדם בסמוך להמלטה. אפשר להעריך שבניסויים אלו מחצית מתוספת האנרגיה (בהשוואה לביקורת) נספגה בכרס, ומחציתה במעי.
פרות חלב מסוגלות לעכל ביום עד כ 2.5 ק"ג עמילן במעי הדק (Reynolds et al., 1997). ידוע גם כי שינויים באופי הנוטריינטים הנספגים מלווים בשינויים מקבילים הדורשים זמן, באברי הספיגה השונים של מערכת העיכול ובכבד (Huntington, 1990). נראה לכן שיש צורך למנוע מעבר חד בהפניית מטבוליטים משלב היובש לשלב ההנבה (הכרוך בעליה פי 2 –3 בצריכת המזון והאנרגיה בפרה). יש לבצע הסתגלות זאת באופן אשר יאפשר לרקמות הסופגות להיות מוכנות מבחינה מטאבולית לקראת השינוי הגדול בזרם הנוטריינטים. בעבודה זו נבחנה השפעת אספקת (ספיגת) פרקורסורים גלוקוגניים בכרס (פרופיונאט, באמצעות עמילן פריק) ובמעי (באמצעות עמילן עוקף כרס) על הקטנת הסטרס האנרגטי של פרת החלב גבוהת התנובה המצויה בתקופת המעבר. כביקורת שמשה מנה שהכילה סיב פריק. כן ניבדקה השפעת פרקורסורים אלה על מדדים מורפומטריים של דופן הכרס. פרופיל אנזימטי. השלב הראשון במטאבוליזם של חש"נ ברקמת הכרס הינו אקטיבציה. מקובל (Britton and Krehbiel, 1993) כי פעילות acetyl-, propionyl-, and butyryl-CoA synthetase קובעות את קצב ניצול החומצות ע"י תאי הכרס. הפעילות של האנזימים acetoacetyl-CoA thiolase, האנזים הראשון במסלול הקטוגני, ו 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase, האנזים קובע הקצב במסלול הקטוגני מושפעים ע"י הרכב המנה (Lane et al., 2002 ). פעילות אנזימים אלו בעקבות הטיפולים התזונתיים נבחנה על ידינו.

 

חומרים ושיטות
הועמדו השיטות להרצת הבדיקות בביופסיות של דופן הכרס. דוגמאות כרס ראשונות נלקחו תחילה מפרות שנמסרו לשחיטה בבית המטבחיים מרבק. דוגמאות אלו שימשו לבדיקות היסטולוגיות, ובדיקות לאמדן הפעילות האנזימתית של תאי דופן הכרס. דוגמאות נוספות נלקחו ישירות מהכרס, של פרות מרפת ולקני המצוידות בפיסולה כרסית בהתאם לפרוטוקול של (et al., 1995 Kelly) המשלב ריקון זמני של הכרס עם לקיחת ביופסיות במספריים, מצאנו כפי שמתואר בספרות שאין כל סיכון לדימום או חשש לבריאות הפרה בטיפול מעין זה.
I נלקחו ביופסיות של דופן הכרס (בגודל של 1-1.5 סמ"ר) ונשמרו בפורמלין 10% לבדיקת מורפומטרית של הפטמיות – אורך, צפיפות, שטח חתך, מידת הסתעפויות. הדוגמאות נצבעו בצביעת המטוקסילין אאוזין סטנדרטית. כן נצבעו התאים לבדיקת התחלקות בשיטת  Proliferating cell nuclear antigen (PCNA).
II פרופיל אנזימטי. מקובל (Britton and Krehbiel, 1993) כי פעילות acetyl-, propionyl-, and butyryl-CoA synthetase קובעות את קצב ניצול החומצות ע"י תאי הכרס. הפעילות של האנזימים acetoacetyl-CoA thiolase, האנזים הראשון במסלול הקטוגני, ו 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase, האנזים קובע הקצב במסלול הקטוגני מושפעים ע"י הרכב המנה (Lane et al., 2002). הועמדו שיטות להערכת פעילות אנזימים אלו, כמו גם של אנזימים נוספים המעורבים בניצול חש"נ ע"י תאי הכרס (propoinyl carboxylase, lactate dehydrogenase ו (pyrovate hydrogenase, בעקבות הטיפולים התזונתיים.
מדוגמאות בית המטבחיים RNA מוצה והועבר ל cDNA באמצעות reverse transcript procedure (100 ng RNA). ה cDNA נשטף לסילוק עקבות הפרימרים, נוקלאוטידים ומלחים. ה cDNA הטהור משמש ב polymerase chain reaction (PCR) להגברת הביטוי הגנטי של האנזימים הרלבנטים. פרימרים ל PCR תוכננו בהתאם לרצפים שמורים מנתונים ב GeneBank (אדם, מכרסמים).
III. כדי לבדוק את חיוניות הרקמות שנבדקו העמדנו בשלב פרלמינרי טסט ביולוגי בו נבחנה קליטת חומצות שומן נדיפות ע"י פיסות הרקמה.
IV. נערך ניסוי ברפת המטאבולית במכון וולקני בעגלות בנות 15 חודש המצוידות בפיסטולה בכרס. נבחנה השפעת הרכב הפחמימות במנה על מבנה ותפקוד פטמיות בכרס. 4 עגלות ברבוע לטיני (21 יום לסיבוב) קיבלו 4 מנות: ביקורת (מנת יבשות), ו3 מנות אנרגטיות: תוספת עמילן פריק כרס (שעורה), תוספת סיב פריק בכרס (קליפות סויה) ותוספת עמילן שרידי כרס (תירס). כל המנות כללו כמות מספקת של סיב. בין הסבבים היתה הפסקה למשך שבועיים בהן העגלות שוחררו מהתאים וקיבלו בליל עגלות רגיל. פריקות פחמימות בכרס חושבה באמצעות שיטת שקי הדקרון.

 

מנת הביקורת – הורכבה מבליל עגלות, קש חיטה מקוצץ וכוספת סויה ביחסי אחוזים של                    4 : 32 : 65בהתאמה
מנת עמילן שרידי- למנת הביקורת הוסף תירס כך שיחסי הרכיבים באחוזים במנה היו   55 : 27 : 3 : 15 מהבליל, קש, כוספת סויה ותירס בהתאמה
מנת עמילן פריק - למנת הביקורת הוספה שעורה כך שיחסי הרכיבים באחוזים במנה היו 55 : 27 : 3 : 15 מהבליל, קש, כוספת סויה ושעורה בהתאמה.
מנת סיב פריק - למנת הביקורת הוספו קליפות-סויה כך שיחסי הרכיבים באחוזים במנה היו 55 : 27 : 3 : 15 מהבליל, קש, כוספת סויה וקליפות סויה בהתאמה.

 

נלקחו ביופסיות של דופן הכרס לבדיקת מורפומטרית של הפטמיות. רמות אמוניה ופרופיל וכמויות חש"נ בכרס נקבעו בשעות שונות. הדוגמאות משמשות למדידת רמות שתנן, גלוקוז, BHBA, NEFA, ואינסולין בדם. בחיות אלו נבדקו צריכת מזון ונעכלות (באמצעות סמן) רכיבי המנה. בשל עיכובים מנהלתיים ברפת אשר לא היו תלויים בצוות החוקרים בניסוי, החל ניסוי זה באיחור של למעלה מחצי שנה. איחור מיותר זה חייב אותנו לשינויים מתבקשים בביצוע התוכנית בהשוואה לתוכנית המקורית.

 

תוצאות  ודיון
תקופת המעבר בפרה, המאופיינת במאזן אנרגיה שלילי, משפיעה בהמשך על פוריות הפרה, בריאותה ויצרנותה בתחלובה העוקבת (Bell, 1995). ניתן להעלות את המאזן האנרגטי של הפרה באמצעות הגברת התסיסה בכרס ע"י הוספת NFC למנה ו/או להגביר את אספקת עמילן עוקף כרס, הנספג במעי והיכול להעלות את אספקת הגלוקוז לפרה (Batajoo, 1993). הנחנו כי העלאת ריכוז המזון המרוכז במנה יעלה את רמת החש"ן וספיגתן בכרס, ו/או ספיגה של עמילן במעי, ישפר את אספקת הגלוקוז לפרה ויקטין את העקה האנרגטית בה היא נמצאת.  
יתרון אפשרי נוסף להעלאת NFC במנה הוא העלאת ספיגת החש"ן מהכרס באמצעות הגברת התפתחות הפאפילות בכרס (Dirksen, 1997). החש"ן שנספג ברקמת הכרס עובר מטבוליזם לפני הגעתו לדם, ולכן התענינו בשאלה מה חלקו של אפיתל הכרס בצריכת המטבוליטים. Bergmam & Wolff (1971) העריכו  שתאי רקמת אפיתל הכרס משתמשים לצרכיהם האנרגטיים ב-30, 50 ו- 90% מהאצטט, פרופיונאט ובוטיראט שנספגים דרכם, בהתאמה. בעבודות שהתבססו על קטטרים בכלי דם במערכת העיכול (Kristensen, 2001,2000a) נמצא כי המטבוליזם של חש"ן באפיתל הכרס איננו גבוה כפי ששוער מלכתחילה אך האחוזים המדויקים אינם ידועים.

 

בטבלה מס 1 מוצגים נתוני צריכת-מזון בחומר יבש, NDF, NFC, וכלל הפחמימות. הנעכלות בכרס נקבעה עפ"י בדיקות שנעשו בשיטת שקי-דקרון לחומר יבש, NDF, NFC, וכלל הפחמימות. הנעכלות בכלל מערכת העיכול חושבה מהפרש בין רכיבי המזון שנצרך לאותם הרכיבים בצואה.  הנעכלות במעי חושבה ע"י ההפרש בין נעכלות בכלל מערכת העיכול לנעכלות בכרס.
צריכת הח"י היתה נמוכה בטיפול הביקורת לעומת מנות הטיפול אך ללא מובהקות. נעכלות ח"י בכרס (38-41%), ובמעי לא היתה שונה בין המנות. הנעכלות הכללית של ח"י במנת הביקורת היתה נמוכה ממנות העמילן שרידי וסיב פריק (P=0.02). את התוצאות השונות שהתקבלו ניתן להסביר ע"י שוני במקורות הגרעינים, גודלם לאחר טחינה, הטיפולים שהם עוברים, ורמתם במנה יחסית לרכיבים אחרים, ולכן משתנית השפעתם על צריכת מזון (Lesmeister, 2004). השימוש בקליפות סויה כתחליף לגרעינים במנת פרות-חלב לא שינה את צריכת המזון גם כאשר רמתן היתה 35% מסך החומר-היבש במנה (Sarwar, 1992).
צריכת NDF במזון היתה, יחסית, נמוכה בטיפול הביקורת וגבוהה במנת הטיפול של סיב פריק אך ההבדל לא היה מובהק. נעכלות NDF בכרס לא היתה שונה בין המנות. נעכלות NDF במעי ובכלל מערכת העיכול במנת הביקורת היתה נמוכה ממנת הסיב הפריק (P≤0.03). צריכת NFC היתה נמוך בביקורת לעומת מנות שהכילו עמילן שרידי ועמילן פריק (P=0.01).  נעכלות NFC בכרס היתה שונה בין כל מנות הטיפול (P<0.0001), כשאחוז הנעכלות הנמוך ביותר היה במנת העמילן השרידי, לאחר מכן במנת הסיב הפריק, מנת הביקורת ואחוז הנעכלות הגבוהה ביותר היה בטיפול עמילן פריק. כידוע לשעורה פריקות של קרוב ל-90% בכרס (McAllisre, 1993; Reynolds, 1993 ).  נעכלות NFC במעי ובכלל מערכת העיכול לא היתה שונה באופן מובהק בין הטיפולים.
כלל הפחמימות  אשר נצרכו במזון היו נמוכים בטיפול הביקורת לעומת מנות הטיפול אך ללא מובהקות. נעכלות כלל הפחמימות  בכרס היתה גבוהה במנת ההזנה של עמילן פריק לעומת מנות הביקורת והסיב הפריק (P=0.005). כלל הפחמימות נעכלו באחוז גבוה יותר במנת הסיב הפריק ובאחוז נמוך במנת העמילן הפריק (P=0.03). הנעכלות הכללית של כלל הפחמימות  במנת הביקורת היתה נמוכה ממנות העמילן שרידי וסיב פריק (P=0.02).

 

אנרגיה מטבולית נצרכת חושבה על בסיס צריכת מזון יומית עבור כל טיפול. האנרגיה המטבולית הפנויה לייצור מחושבת בהפרש בין אנרגיה מטבולית נצרכת לבין אנרגיה מטבולית לצרכי קיום. האנרגיה המטבולית הנצרכת במזון והאנרגיה המטבולית הפנויה לייצור היו נמוכות במנת הביקורת (17.6 ו 6.8 מק"ל ליוום)  ממנת העמילן השרידי (27.2 ו 17.5) והסיב הפריק (22.3 ו 11.5 מק"ל ביום) (P = 0.03). יש לציין כי גם העגלות בטיפול הביקורת היו במאזן אנרגיה מחושב חיובי אך עם אנרגיה מטבולית פחותה פנויה לייצור.

 

ניתן לראות בטבלה מס. 2. כי ממוצע הריכוזים של טריגליצרידים, כולסטרול (כ130  mg/dl (, גלוקוז (80-85 (mg/dl, אינסולין (pg/ml0.4 - 0.7) ו – BHBA  (2.4-2.6 (mg/dl אינם שונים בין הטיפולים. ריכוז NEFA בפלסמה בעגלות הניסוי של מנת הביקורת היה גבוה במנת הביקורת (P=0.01)  ונמוך ביותר במנת העמילן השרידי. תוצאה זו התקבלה גם בשבוע הראשון (P=0.03) והשבוע השלישי בסבב (P=0.04). תוצאה זו מצביעה על מחסור אנרגטי בעגלות שקיבלו את מנת הביקורת. ההבדלים במשקלי העגלות  בין תחילת לסוף הסבב וצריכת מזון מאוששים זאת. גם בעבודות שבדקו רמת NEFA בפרות לקראת המלטה (Holcomb, 2001;Doepel, 2002) נמצא כי בעליית NFC  במנה ירדה רמת NEFA בפלסמה. 
רמת הטריגליצרידים בשבוע הראשון נטו (P= 0.07) להיות גבוהים ביותר במנת הביקורת לעומת שאר הטיפולים. מאחר שרמת NEFA עלתה בקבוצת הביקורת בשל המנה המדוללת עם קש, גם רמת הטריגליצרידים עלתה, אך משום שהעגלות הללו לא היו במאזן אנרגיה שלילי, היתה כנראה התאמה מבחינה מטבוליזם בכבד למנה ובהמשך הסבב רמת  טריגליצרידים ירדה ולא התקבל הבדל בין המנות. ערכי PUN  במנת הביקורת היו גבוהים (P=0.04) והערך הנמוך ביותר התקבל במנת העמילן השרידי. תוצאה זו התקבלה גם בשבוע הראשון (P=0.03) בסבב. PUN גבוה מעיד על מטבוליזם חלבון, כנראה שבטיפול הביקורת היה פיצוי אנרגטי ע"י פירוק חלבון, תוצאה התואמת לרמה הגבוהה של NEFA  בקבוצת הביקורת.

 

רמת ה-pH הממוצעת שהתקבלה במיץ כרס של עגלות הניסוי היתה בין 7.1-7.2 ולא היתה שונה בין הטיפולים (טבלה 3). יש לציין שהדגימות נלקחו לפני הגשת המזון. תוצאה זו מעט גבוהה מהדווח בספרות, ונבעה כנראה מרמת הקש הגבוהה במנות. היקף, אופי ומהירות התסיסה בכרס ע"י מיקרואורגניזמים משפיעים על ריכוזי החש"ן שיווצרו בכרס ושינויים אילו משפיעים על רמת החומציות. רמת החומציות בכרס בקר בוגר נעה בין 5.5-7 וגורמים נוספים שיכולים לשנות את רמת pH בכרס הם: קצב ספיגת החש"ן (אשר מושפע מהתפתחות אפיתל הכרס) נפח זרימת רוק (כבופר) וקצב זרימת המעכל מהכרס (Dirksen, 1997). לרמת החומציות בכרס מייחסים השפעה ניכרת על צריכת ח"י ועל נעכלות המנה ומכאן חשיבותה (Church, 1988).
ריכוז החש"ן הכללי, נהיו מוכים מעט מהמקובל בספרות (France, 1993). ריכוז החש"ן היה נמוך במנת הביקורת לעומת מנת העמילן השרידי (P=0.02). אחוזי האצטט (בין 78-82%), הפרופיונאט (בין 20-23%) והבוטיראט (8.7-9.5%) דמו בין הטיפולים. יחס בין חומצה אצטית לחומצה פרופיונית היה בין 3.6-4 בטיפולים השונים. ערכים דומים התקבלו בספרות (Feng, 1995; Ipharraguerre, 2003)  כאמור בניסוי הנוכחי המנה היתה יחסית גסה (גם במנות עם תוספת הפחמימות המזון הגס היווה 85% מהמנה) מה שמסביר את הריכוז היחסית נמוך של החש"ן והפרופיל שלו.

לא התקבלו הבדלים בין אורכי הפאפילות (3-4 מ"מ) בטיפולי ההזנה השונים (טבלה 4). בטיפול עם תוספת עמילן שרידי רוחב הבסיס של הפאפילות בהשואה למנת הביקורת (P=0.03). נתוני הגדלים של רוחב אמצעי, רוחב קצה ושטח הפאפילה דמו בין הטיפולים. אחוז התאים המתחלקים נע בין 52% במנת העמילן הפריק ל- 60% במנת הסיב הפריק, ללא הבדלים בין הטיפולים. צמיחה של הפאפילות מעלה את שטח הספיגה של דופן הכרס כך שבכרס עם מוקוזה מפותחת ריכוז החש"ן ירד פי 5 יותר בשעה הראשונה מאשר בכרס עם מוקוזה נמוכה (Dirksen, 1997). , Dirksen et al (1985) הראו שהפחתה באחוז הסיב המנה לפני המלטה מעודדת פרוליפרציה של פאפילות הכרס ומעלה את יכולת הספיגה של חש"ן.

 רמת ביטוי mRNAשל אנזימים מבקרי חש"נ באפיתל הכרס מוצגת בטבלה מס. 5. בעבודות שבדקו את קצב הייצור בכרס ורמת החש"ן בדם הפורטלי מצאו כי  18-30% מהאצטט, 30-70% מהפרופיונאט ו- 74-90% מהבוטיראט עברו מטבוליזם ע"י דופן הקיבות במהלך ספיגתם (Remond, 1995). חמצון מלא של חש"ן יכול לספק כמות גבוהה של אנרגיה לתאי הדופן, אך חימצון איננו המסלול האפשרי היחיד. לאחר שלב זה ישנם מס' תהליכים ביוכימיים שכל חומצה יכולה לעבור ומעבודה שנעשתה in Vitro (Waldron, 2002) על מטבוליזם חש"ן ע"י תאי אפיתל הכרס התקבלו גופי-קטו, פירובט ולקטט. הפרקורסור העיקרי לקטוגנזה בדופן הכרס הוא בוטיראט שממנו נוצר BHBA. לעומת זאת, פרופיונאט אינו מוביל ליצירת גופי-קטו והתוצרים הסופיים שלו הם לקטט CO2 וכמויות קטנות של פירובט (Harmon, 1991). הצעד הראשון למטבוליזם של חש"ן הוא תהליך אקטיבציה של אצטט, פרופיונאט ובוטיראט ע"י יצירת אסטר-CoA לכל חומצה. נקודת הבקרה על שלב זה, כנראה, חיונית לתהליך ניצול חש"ן בכרס.
ההבדלים ברמת הביטוי של Acetyl-CoA Synthase בתחילת הסבב נטו להיות נמוכים בטיפול הביקורת, בו התקבל ביטוי יחסי של 0.8, לעומת מנת העמילן השרידי,  בה הביטוי היחסי היה 1.2 (P=0.07). בסוף הסבב ההבדלים ברמות הביטוי התמתנו והיו בין 0.86 בסיב הפריק ל-1 בטיפול העמילן הפריק ללא הבדלים מובהקים.  אצטט עובר פחות מטבוליזם בכרס משאר החומצות ורובו מועבר לדם (18-30%) לשימוש שאר הרקמות. יתכן שבתחילת הסבב, המחסור בנוטריאנטים בעגלות שהוזנו במנת הביקורת היווה משוב שלילי לחמצון אצטט וגרם למעבר גדול יותר לזרם הדם ואילו בסוף הסבב היתה אדפטציה למסלולים ביוכימיים אחרים אשר הופעלו לצרכים האנרגטיים של החיה כך שרקמת אפיתל הכרס חמצנה יותר אצטט. בעגלות שהוזנו במנת העמילן השרידי רמת הביטוי היתה גבוהה בהתחלה שכן המנה אשר ניתנה להן סיפקה את הדרישות האנרגטיות. בסוף הסבב לא היה הבדל יחסית לשאר המנות שכן ייתכן והעגלות עברו התאמה פיסיולוגית למנה.
ברמת הביטוי היחסי של Propionyl-CoA Carboxilase בתחילת הסבב, נמצא הבדלי בין הטיפול בעמילן שרידי, בו הביטוי היחסי היה הגבוה ביותר - 1.5, לבין הטיפול בסיב פריק בו רמת הביטוי עמדה על 1.1 (P= 0.04). בסוף הסבב רמת הביטוי נעה בין 1 במנת הביקורת ל-1.3 במנת הסיב הפריק, אך הבדלים אילו לא היו מובהקים. ההסבר האפשרי לתוצאה זו הוא שבמנת העמילן השרידי היה פחות NEFA בדם והתוספת הפחמימנית בטיפול סיפקה יותר גלוקוז שנספג במעי. מאחר שלא היו הבדלים משמעותיים באספקת האנרגיה בין טיפולי הסיב הפריק לעמילן השרידי נראה שהבקרה על חמצון פרופיונאט בתאי הכרס נובעת מהורמונים או מטבוליטים בדם. כך, שבזמן מחסור הנוטריאנטים בחיה, קצב העברת חש"ן מהכרס לדם עולה וכשאין צורך אנרגטי הפאפילות מחמצנות יותר חש"ן לצרכיהן. ממצא זה תואם גם למתקבל בביטוי Acetyl-CoA Synthase וההבדל ברוחב הבסיס של הפאפילות בטיפול בעמילן שרידי (כאמור למעלה). בנוסף, Weekes (1974) הראה כי ייצור לקטט ופירובט מפרופיונאט לא מושפע מחש"ן אחרים אך ייצורם עולה בנוכחות גלוקוז ויורד בנוכחות NH3. השפעת פרופיונאט ואצטט על ייצור גופי קטו פחות ברורה.
רמת הביטוי היחסית של Butyryl-CoA Synthase בתחילת הסבב ההבדלים נעו בין 0.47 במנת העמילן השרידי ל-0.93 במנת הביקורת ובסוף הסבב בין 0.23 בטיפול הסיב הפריק ל-0.84 במנת הביקורת. לא היו הבדלים מובהקים בין מנות הטיפול השונות. העובדה שבוטיראט הוא מטבוליט מועדף על תאי אפיתל הכרס (Harmon, 1991), יכולה להסביר את רמת הביטוי הגבוהה יחסית במנת הביקורת לשאר הטיפולים, שכן בטיפול זה היה מחסור אנרגטי יחסית לשאר הטיפולים.  Beck et al (1984) הראו כי העלאת ריכוז בוטיראט במדיום, באינקובציה של תאי-אפיתל כרס, גרם לירידה בחמצון בוטיראט ל-CO2 ולעלייה בייצור גופי קטו. השינויי ברמת הביטוי היחסית של האנזים HMG-CoA Synthase בין המנות ובין תחילת לסוף הסבב היה מינורי. תוצאה זו תואמת את העובדה שלא היה שינוי בביטוי Butyryl-CoA Synthase או ברמת BHBA בדם. רמת הביטוי של mRNA היחסית של האנזים HMG-CoA Synthase בתחילת הסבב נע בין 1.1 בתוספת הסיב הפריק והעמילן הפריק ל- 1.4 התוספת העמילן השרידי. בסוף הסבב בין רמת הביטוי הנמוכה ביותר היתה עבור עמילן פריק ושרידי (ביטוי יחסי של 1) והגבוהה ביותר במנת הביקורת (ביטוי יחסי של 1.2). לא היו הבדלים מובהקים בין מנות הטיפול השונות בתחילת וסוף סבב.
רמת ביטוי mRNA היחסית של האנזים Lactate Dehydrogenase  נעה בין 0.9 ל-0.7 במנת העמילן השרידי בין תחילת לסוף הסבב; עבור מנת העמילן הפריק השינוי נע בין 0.9 בהתחלה ל-0.6 בסוף; בטיפול עם הסיב הפריק הרמה נשארה קבועה סביב 0.7; ובמנת הביקורת רמת הביטוי ירדה מ- 40.9 ל- 0.78 בסוף הסבב.
בביטוי היחסי של האנזים Lactate Dehydrogenase  לא היו הבדלים בין הטיפולים בין תחילת לסוף הסבב ובין המנות כך שהעלייה שקיבלנו עבור Propionyl-CoA Carboxilase יכולה להעיד על חמצון מלא של פרופיונאט. בהעלאת רמת ספיגת פרופיונאט, in vivo, ייצור BHBA יורד בעוד שמידת המטבוליזם של בוטיראט לא מושפע (Seal & Parker, 1994).
עבודות שבדקו in vitro  את פעילות האנזימים  Acyl-CoA Synthaseברקמת הכרס Harmon, 1991) ) מצאו שנוכחות של חומצה אחת משפיעה על קצב הספיגה והמטבוליזם של חומצה אחרת. למשל, נוכחות של בוטיראט מורידה את פעילות Propionyl CoA Synthase  ב-82-89% (תלוי בשיטת הבדיקה), נוכחות בוטיראט ופרופיונאט מורידות את פעילות Acetyl CoA Synthase ב-71% ואילו פעילות Butyryl CoA Synthase כמעט (0-14%) לא משתנה בשל נוכחות חומצות אחרות. מהנתונים שהצגנו ניתן לומר שמכניזם יחיד לא יכול להסביר את הבקרה בתהליכי הספיגה והמטבוליזם של חש"ן באפיתל הכרס ושבניסויי in vitro לא ניתן לראות את  השפעות של המצב הפיסיולוגי של החיה השלמה על רקמת אפיתל הכרס.

בדקנו גם את המתאמים בין המדדים שנבדקו בחיה השלמה (נעכלות הפחמימות, אנרגיה מטבולית ומשקל העגלות), מדדי נוזלי הכרס והדם (חש"ן, pH, מטבוליטים והורמונים) לבין נתוני אפיתל הכרס (שינוי רמות ביטוי אנזימטיות והיסטולוגית דופן הכרס):
בצריכת ונעכלות NFC היתה בהתאמה (0.01P<) עם אורך הפאפילות בסוף הסבב. תוצאה זו מתאימה לממצאים בספרות שכן בעבודות של Dirksen et al (1985, 1997) נמצא כי העלאת תכולת NFC במנה מעודדת התפתחות פאפילות הכרס ומכאן את יכולת הספיגה של דופן הכרס..
נעכלות כלל הפחמימות היה בהתאמה (0.05P<) עם אחוז התאים המתחלקים בסוף הסבב. תוצאה זו מעידה על מנגנון בקרה על חלוקת התאים כתוצאה מהמצב האנרגטי של בע"ח. שכן בעליית נעכלות כלל הפחמימות המאזן האנרגטי של עגלות הטיפול היה טוב יחסית לקבוצת הביקורת, עודד התחלקות תאים האפיתל הכרס.
עלייה בביטוי Acetyl-CoA Synthase בסוף הסבב היתה בקורלציה ישירה (0.05P<) עם אורך הפאפילה בסוף הסבב. מתוצאות רמת ביטוי אנזים זה הסקנו כי במצב של מחסור בנוטריאנטים בעגלות שהוזנו במנת הביקורת יתכן שמתקיים משוב שלילי לחמצון אצטט כך שבביטוי גבוה יותר של Acetyl-CoA Synthase אין מחסור המטבוליטים והפאפילות של אפיתל הכרס גדלו.
עלייה בסך אחוז הבוטיראט בכרס היה בהתאמה (0.01(P< עם אורך הפאפילות בסוף הסבב. ידוע כי בוטיראט הינו המטבוליט המועדף והמשפיע ביותר על מטבוליזם בתאי אפיתל הכרס (Harmon, 1991), מה שיכול להשפיע על שגשוג התאים לצמיחת הפאפילות. למשל,  בזמן רעב, כשרמת חש"ן בכרס יורדת, אפיתל הכרס יכול לחמצן חומצות-שומן ארוכות לצרכי אנרגיה. במצב רגיל חמצון זה מעוכב בנוכחות בוטיראט ואמוניה. עלייה ברמת NEFA בדם היתה בהתאמה (0.01 P<)  עם עליית הביטוי של Butyryl-CoA Synthase. עלייה ברמת NEFA  בדם מעידה על מחסור אנרגטי בנוטריאטים בדם מה שמסביר את השימוש העולה של תאי אפיתל הכרס בבוטיראט.עלייה ברמת גלוקוז בדם היתה במתאם חיובי (0.001P<) לעליית אחוז התאים המתחלקים לכל אורך הפאפילות. תוצאה זו מראה כי השפעת מצב הנוטריאנטים בדם הינה משמעותית לעידוד הפרוליפרציה בתאי אפיתל הכרס. ואמנם מהחתכים ראינו שהתאים המתחלקים מרוכזים קרוב לכלי דם הפאפילה.
עלייה ברמת BHBA בדם היתה במתאם חיובי (0.01 P<) לעליית אחוז התאים המתחלקים לכל אורך הפאפילות. רמת BHBA עולה עם עלייה של גלוקוז כאשר יש מספיק מקורות אנרגטיים מכלל מערכת העיכול ותאי הכרס מעבירים חלק גדול יותר של בוטיראט לדם מאשר לשימוש בתאים. תוצאה שמתאימה לנאמר בסעיף הקודם – הפרוליפרציה בתאי אפיתל הכרס מושפעים מנוטריאנטים בדם.
שינויים מורפולוגיים באפיתל הכרס אשר מושרים ע"י כמות צריכת מזון והרכבו, מתרחשים במקביל להתאמה מטבולית בתאי האפיתל. Harmon )1991) דיווח כי ככל שצריכת המזון עולה גם רמת החש"ן בכרס עולה ולכן גורמת לעלייה ברמת Acyl-CoA synthase באפיתל. העלייה בפוטנציאל לאיקטוב חש"ן לוותה בעלייה בקטוגנזה וייצור לקטט ופירובט בעוד שקצב חימצון מלא של אצטט,פרופיונאט ובוטיראט לא השתנה. עלייה בייצור פירובט מפרופיונאט יכול לשמש ומקור ל- NADPH הנחוץ לתהליכי ביוסינטזה בחלוקת התא.

 

סיכום

• עגלות ופרות ביובש במאזן אנרגיה שלילי יכולות לשמש מודל להערכת השפעות סוגי מזון על מדדים מגוונים שניתן יהיה ליישמם בפרות בתקופת מעבר.
• כנראה שהבקרה על מורפולוגיה והמטבוליזם בדופן הכרס מתקבלת כתוצאה ממטבוליטים והורמונים בדם ולא רק בנוזל הכרס. לכן ניתן לקבל תמונה מדוייקת יותר של המטבוליזם בתאי אפיתל הכרס בהשפעת הרכב המזון מניסויי  in vivo מאשר ניסויי in vitro.
• ממגוון התוצאות שהושגו בעבודה זו ניתן להסיק כי התוספת הפחמימנית המומלצת לפרות לקראת המלטה היא תוספת עמילן שרידי (תירס).

 

טבלה מס. 1. צריכת ונעכלות מזון ונוטרינטים במערכת העיכול
  

 

טבלה מס. 2. ריכוזי מטאבוליטים בדם.

 

טבלה מס .3. מדדי התסיסה בכרס.
 





 

 

ספרות

Arieli A., U Dicken, I. Dagoni, Y. Spirer and S. Zamwel. 2008. Production and health traits of cows administered with monensin prepartum and fed a high-energy diet postpartum.  (Accepted, J. Dairy Sci.)
Batajoo, K. K., and R. D. Shaver, 1994. Impact of Nonfiber Carbohydrate on Intake,
Digestion, and Milk Production by Dairy Cows: J. Dairy Sci. 77:1580-1588..
Bell A. W. 1995. Regulation of organic nutrient metabolism during transition from late pregnancy to early lactation. J. Anim. Sci. 73:2804-2819.
Bergman, E. N., 1971. Hyperketonemia-Ketogenesis and Ketone Body Metabolism:
J. Dairy Sci. 54: 936-945.
Bertics, S. J., Grummer, R.R., Cadorniga-Valino, C. and Stoddard E. E. 1992. Effect of prepartum dry matter intake on liver triglyceride concentration and early lactation. J. Dairy Sci. 75:1914-22.
Britton R. and Krehbiel C. 1993. Nutrient metabolism by gut tissues. J Dairy Sci. 76:2125-2131.
Church, D. C., 1988. The ruminant animal: Digestive Physiology and Nutrition: Prentice Hall, New Jersy, U.S.A.
Dirksen et al (Dirksen, G., H. G. Liebich, and E. Mayer, 1986, Functional-Significance of Adaptive Changes of Rumen Mucosa of Ruminants: Praktische Tierarzt, 67:73-75.
Dirksen G, Dori S.,Arbel A. Schwarz M and Liebich H.G. 1997. The rumen mucosa - its importance as a metabolic organ of the high producing dairy cow. Israel J. Vet. Med. 52:73-79.
Doepel, L., H. Lapierre, and J. J. Kennelly, 2002, Peripartum performance and metabolism of dairy cows in response to prepartum energy and protein intake. J. Dairy Sci. 85:2315-2334.
Duffield, T. F., D. Sandals, K. E. Leslie, K. Lissemore, B. W.McBride, J. H. Lumsden, P. Dick, and R. Bagg.  1998.  Efficacy of monensin for the prevention of subclinical ketosis in lactating dairy cows.  J. Dairy Sci.  81:2866-2873.
Duffield, T. F., K. E. Leslie, D. Sandals, K. Lissemore, B. W. McBride, J. H. Lumsden, P. Dick, and R. Bagg.  1999.  Effect of prepartum administration of monensin in a controlled-release capsule on milk production and milk components in early lactation.  J. Dairy Sci.  82:272-279.
Feng, P., C. W. Hunt, G. T. Pritchard, and S. M. Parish, 1995, Effect of Barley Variety and Dietary Barley Content on Digestive Function in Beef Steers Fed Grass Hay-Based Diets:. J. Anim. Sci. 73:3476-3484.
France, J., J.M. Forbes and J. Dijkstra, 1993, Quantitative Aspects Of Ruminant Digestion And Metabolism.
Greenfield R.B., Cecava M.J. and Donkin S.S. 2000. Changes in mRNA expression for  gluconeogenic enzymes in liver of dairy cattle during the transition to lactation. J. Dairy Sci. 83:1228-1236.
Grum D. E., Drackley J. K., Younker R. S., LaCount D. W. and Veenhuizen J. J. 1996. Nutrition during the dry period and hepatic lipid metabolism of periparturient dairy cows. J. Dairy Sci. 79:1850-1864.
 (Grummer R.R. 1993. Etiology of lipid-related metabolic disorders in periparturient dairy cows. J. Dairy Sci. 76:3882-96.
Harmon, D. L., K. L. Gross, C. R. Krehbiel, K. K. Kreikemeier, M. L. Bauer, and R. A. Britton, 1991, Influence of Dietary Forage and Energy Intake on Metabolism and Acyl-Coa Synthetase Activity in Bovine Ruminal Epithelial Tissue. J. Anim. Sci. 69:4117-4127.
Holcomb, C. S., H. H. Van Horn, H. H. Head, M. B. Hall, and C. J. Wilcox. 2001. Effects of prepartum dry matter intake and forage percentage on postpartum performance of lactating dairy cows: J. Dairy Sci. 84:2051-2058.
Huntington, G. B. 1990. Energy metabolism in the digestive tract and liver of cattle: influence of physiological state and nutrition. Reprod. Nutr. Dev. 30: 35-47.
Ipharraguerre, I. R., Z. Shabi, J. H. Clark, and D. E. Freeman, 2002b, Ruminal fermentation and nutrient digestion by dairy cows fed varying amounts of soyhulls as a replacement for corn grain. J. Dairy Sci. 85:2890-2904.
Kelly J. M., A. S. Vaage, L. P. Milligan and B.W.T. McBride. 1995. In vitro ouabain sensitive respiration and protein synthesis in rumen epithelial papillae of Hereford steers fed either timothy hay or timothy hay supplemented with cracked corn once daily. J. Anim. Sci. 1995. 73:3775–3784.
Kristensen, N. B., G. Gabel, S. G. Pierzynowski, and A. Danfaer, 2000, Portal recovery of short-chain fatty acids infused into the temporarily isolated and washed reticulorumen of sheep: Br. J. Nutr. 84:477-482.
Kristensen, N. B., and D. L. Harmon, 2004, Splanchnic metabolism of volatile fatty acids absorbed from the washed reticulorumen of steers. J. Anim. Sci. 82:2033-2042.
Lane M.A., Baldwin R.L. VI and Jesse B.W. 2002. Developmental changes in ketogenic enzyme gene expression during sheep rumen development. J. Anim. Sci. 80:1538-1544.
Lesmeister, K. E., P. R. Tozer, and A. J. Heinrichs, 2004, Development and analysis
of a rumen tissue sampling procedure: J.  Dairy Sci. 87:1336-1344.
Mallard, B. A., J. C. Dekkers, M. J. Ireland, K. E. Leslie, S. Sharif, C. Vankampen, L. Wagter and B. N. Wilkie. 1998. Alteration in immune responsiveness during the periparturient period and its ramification on dairy cow and calf health. J. Dairy Sci. 81:585-595.
McAllister, T. A., R. C. Phillippe, L. M. Rode and K. J. Cheng. 1993. Effect of the protein matrix on the digestion of cereal grains by ruminal microorganisms. J. Anim. Sci. 71:205-212.
Minor D. J., Trower S. L., Strang B. D., Shaver R. D. and Grummer R. R. 1998. Effect of nonfiber carbohydrate and niacin on periparturient metabolic status and lactation of dairy cows. J. Dairy Sci. 81:189-200.
NRC, National Research Council., 1989. Nutrient Requirements of Dairy Cattle. 6th  rev. ed. Natl. Acad. Sci., Washington, DC.
Remond, D., I. Ortigues and J. P. Jouany. 1995. Energy Substrates for the Rumen Epithelium. Proc. Nutr. Soc. 54: 95-105.
Reynolds, W. K., C. W. Hunt, T. Moen, and J. A. Loesche, 1993, Comparison of Corn
and Barley with and without Ruminal Buffer in Supplements Fed in Wheat Straw-Based Diets to Beef Steers. J. Anim. Sci. 71:1326-1334.
Reynolds, C. K., J. D. Sutton, and D. E. Beever. 1997. Effect of feeding starch to dairy cattle on nutrient availability and production. p. 105-134 In Recent Advances in Animal Nutrition Eds. Garnsworthy, P.C., Wiseman, J., Haresign, W., Nottingham Univ. Press, Loughborough, UK.
Sarwar, M., J. L. Firkins and M. L. Eastridge. 1991. Effect of replacing neutral detergent fiber of forage with soyhulls and corn gluten feed for dairy heifers. J. Dairy Sci. 74:1006-1017.
Seal, C. J., and D. S. Parker, 1994. Effect of Intraruminal Propionic Acid Infusion on
Metabolism of Mesenteric-Drained and Portal-Drained Viscera in Growing . Steers Fed a Forage Diet. J. Anim. Sci. 72:1325-1334.
Stephenson, K. A., I. J. Lean, M. L. Hyde, M. A. Curtis, J. K. Garvin,and L. B. Lowe.  1997.  Effects of monensin on the metabolism of periparturient dairy cows. J. Dairy Sci.  80:830-837.
Van Nevel C. J. 1991. Modification of rumen fermentation by the use of additives. In: Rumen Microbial Meatbolism and Ruminant Digestion. Ed. Jouany J.-P., INRA, Paris.
Weekes, T. E. C., 1974. Invitro metabolism of propionate and glucose by rumen epithelium: Comp. Bioch.Physiol. 49:393-406. Propionyl-CoA Carboxilase

 

לכל המבזקים....
office@milk.org.il פקס: 972-3-9564766 טל: 972-3-9564750 דרך החורש 4 , ת"ד 97, יהוד 5647003
מופעל באמצעות מעוף - מגוון אפקט