מס' תוכנית: 362-0218

 

שיפור פוריות פרות חוזרות ע"י שימוש בעובר מרביית בתולין ועוברים IVF


סיכום תוצאות ניסוי 2010-2008


תקציר
שיפור שעור התעברות פרות חוזרות ע"י השתלה תומכת של עוברים. בשנים האחרונות נצפית ומדווחת ירידה עולמית בפוריות עדר החלב, ובמיוחד בפרות שטופחו גנטית לתנובת חלב גבוהה. בנוסף מדווח על עליה במספר ההזרעות הדרושות עד לקבלת הריון ומכאן שהחלק היחסי בעדר של פרות חוזרות שהרו לאחר למעלה משלוש הזרעות גם הוא עלה. תופעת הפרות החוזרות היא אחד הגורמים החשובים המעיבים על הצלחת כלכלית של ניהול רפת לחלב. הסיבות לתופעה של פרות חוזרות הן רבות ושונות אך אין ספק שהירידה בפוריות בעדר החלב קשורה לתנובת חלב גבוהה. פתרונות שונים הוצעו לשיפור הפוריות וביניהם גם תמיכה בהזרעות ע"י שימוש בהשתלת עובר. טכנולוגיה זו יכולה לעקוף מספר סיבות לחוסר פוריות כמו כשלון בהפריה או הפלות בתחילת הריון במיוחד במצב של תנאי עקת חום השוררים בארץ בחודשי הקיץ. מעבודות של (Dochi et al, 2007) נמסר על עליה משמעותית בשיעור התעברות פרו חוזרות כאשר משתילים עובר IVF 8-7 ימים לאחר הזרעה בעגלות ובפרות. הבסיס לעבודה הזאת היא שהוספת עוברים נוספים מעלה את מספר תאי הטרופובלסט ומגדילה את ההפרשה של אינטרפרון-טאו IFNT)) (Heyman et al, 1987,Hashida et al, 2005). בנוסף בעבודה של (Kawarasaki et al, 2009) נעשה שימוש בעוברים פרתנוגנטים בחזירים כדי לתמוך בהריון מוצלח של עובר יחיד רגיל. נמצא ש-40% מן העוברים פרתנוגנטים שהושתלו בהם התפתחו עד לשלושים יום של הריון. עוברים אלו גרמו להריון מדומה אצל נקבות החזירים ונמצאה שחלה פעילה עם גוף צהוב תקין. כתוצאה מכך הייתה תמיכה בעובר שנוצר מהפריה הרגילה שאלמלא העוברים הפרתנוגנטיים לא היה מתפתח עד תום ההיריון.
לשיפור פוריות פרות חוזרות שקבלו בין 3 עד 6 הזרעות, בין השנים 2009-2008, בצענו השתלה תומכת של עוברים בני 8-7 ימים של הזרעה מלאכותית בשני סוגים של עוברים. שהופקו משחלות בית מטבחיים עוברים פרתנוגנטים (רביית בתולין) ועוברים IVF (מהפריות מבחנה). עוברים אלה גודלו בתנאי מעבדה הוקפאו בשיטת ויטריפיקציה ונשמרו בחנקן נוזלי עד ליום השתלה.
בשנת 2008 בקיבוץ שובל היו לנו תוצאות מאד טובות של השתלת עובר בלסטוציסט (IVF יום 7) התוצאות היו 7 הריונות מתוך 14 השתלות (50%) והיו טובות יותר מהשתלות עוברים פרתנוגנטיים 27% (8/30) ובקורת 24% (29/120). תוצאות בדיקת האבהות של העגלים שהתקבלו מתוך 7 ההריונות מעידות על השרשה של העוברים שהתקבלו מההזרעה ולא מעוברי הIVF. לצערנו בשנת 2009 לא הצלחנו לחזור על ההצלחות של שנת 2008 ולכן החלטנו לעבור להשתלת עובר תומך בן יום בשנה אחרונה של הניסוי. בשנה הנוכחית (2010) ובשונה משעשינו בשנים קודמות השתמשנו בפרות (עם 7-3 הזרעות) ותמיכת ההיריון נעשה על-ידי השתלת עוברי IVF טריים בני 2 תאים (לא מוקפאים), שהתקבלו יום קודם לכן במעבדה מהפריית ביציות מבתי המטבחיים בזרע פר איכותי וידוע. השתלת העובר הצעיר התבצעה בו-זמנית עם ההזרעה הרגילה של הפרה בזרע פר אחר.
ניתן לראות מהתוצאות שלמרות שהניסוי נפסק ולא הגענו למספר רב של השתלות ,המגמה היא חיובית וקיבלנו אחוז התעברות גבוה במיוחד בהזרעות 3-4 (46%= 13 מתוך 28). אחוז התעברות של 46% (ממוצע מ4 משקי קיבוצים) הוא אף גבוה יותר מהממוצע הכללי של ההתעברות של המשקים בתקופה זו. השתלת עובר שמקדים ביממה את העובר (יום1) שיתקבל מההזרעה מאפשר תנאים טובים יותר לעובר ההזרעה מסיבה שאינה ידועה לנו. אנו משערים שהעובר המושתל גורם מסיבה כלשהי להשרשה טובה יותר של העובר מההזרעה.


מבוא ותיאור הבעיה
בשנים האחרונות נצפית ומדווחת ירידה עולמית בפוריות עדר החלב, ובמיוחד בפרות שטופחו גנטית לתנובת חלב גבוהה. בנוסף מדווח על עליה במספר ההזרעות הדרושות עד לקבלת הריון ומכאן שהחלק היחסי בעדר של פרות חוזרות שהרו לאחר למעלה משלוש הזרעות גם הוא עלה. תופעת הפרות החוזרות היא אחד הגורמים החשובים המעיבים על הצלחה כלכלית של ניהול רפת לחלב. הסיבות לתופעה של פרות חוזרות הן רבות ושונות אך אין ספק שהירידה בפוריות בעדר החלב קשורה לתנובת חלב גבוהה. פתרונות שונים הוצעו לשיפור הפוריות וביניהם גם תמיכה בהזרעות ע"י שימוש בהשתלת עובר נוסף. טכנולוגיה זו יכולה לעקוף מספר סיבות לחוסר פוריות כמו כשלון בהפריה או הפלות בתחילת הריון במיוחד במצב של עקת חום בתנאים השוררים בארץ בחודשי הקיץ.
מסתבר שהאות הראשון להכרה אימהית של העובר בבקר נובע מאינטרפרון-תאו. זהו תוצר חשוב שמייצר העובר המתפתח( Conceptus) בכבשים ובקר בתקופה שלפני שהעובר המתפתח מתקשר לקיר הרחם (Trophoblast) ומתחיל לייצר שליה. התפקיד החשוב ראשוני של אינטרפרון-תאו הוא למנוע חזרה של פעילות שחלתית ולאפשר המשך ההיריון (R.M. Roberts, 2008). כאמור אינטרפרון- טאו פועל כאות (signal) הראשון להכרה אימהית של העובר בבקר, בסביבות שבוע שלישי של ההיריון והצמדות של העובר לקיר הרחם, האם "יודעת" על הריון וחיי הגוף הצהוב מתארכים, תופעה הזו נקראת Maternal recognition of pregnancy (Imakawa et al, 1987).
מעבודות של (Dochi et al, 2008) נמסר על עליה משמעותית בשיעור התעברות פרות חוזרות כאשר משתילים עובר IVF לאחר הקפאה, 8-7 ימים לאחר הזרעה בעגלות ובפרות. הבסיס לעבודה הזאת היא עבודה המראה שהוספת עוברים נוספים מעלה את מספר תאי הטרופובלסט ומגדילה את ההפרשה של אינטרפרון-טאו IFNT)) (Heyman et al, 1987,Hashida et al, 2005).
בנוסף בעבודה של (Kawarasaki et al, 2009) נעשה שימוש בעוברים הפרתנוגנטים בחזירים כדי לתמוך בהריון מוצלח של עובר יחיד רגיל. נמצא ש-40% מן העוברים פרתנוגנטים שהושתלו בהם התפתחו עד לשלושים יום של הריון. עוברים אלו גרמו להריון מדומה אצל הנקבות ונמצאה שחלה פעילה עם גוף צהוב תקין. כתוצאה מכך הייתה תמיכה בעובר הבודד שנוצר מהפריה הרגילה שאלמלא העוברים הפרתנוגנטיים לא היה מתפתח עד תום ההיריון.
לשיפור פוריות פרות חוזרות שקבלו בין 3 עד 6 הזרעות, בין השנים 2009-2008, בצענו השתלה התומכת בעובר מהזרעה מלאכותית בעזרת שני סוגים של עוברים, שהופקו משחלות בית מטבחיים. עוברים פרתנוגנטים (רביית בתולין) ועוברים IVF (הפריות מבחנה). עוברים אלה גודלו בתנאי מעבדה עד לשלב הבלסטוציסט ביום 8-7 הוקפאו בשיטת ויטריפיקציה ונשמרו בחנקן נוזלי עד להפשרתם ביום השתלה.


בשנה הנוכחית (2010) ובשונה משעשינו בשנים קודמות השתמשנו בפרות (עם 7-3 הזרעות) ותמיכת ההיריון נעשת על-ידי השתלת עוברי IVF טריים בני 2 תאים (לא מוקפאים), שהתקבלו יום קודם לכן במעבדה מהפריית ביציות מבתי המטבחיים בזרע פר איכותי וידוע. השתלת העובר הצעיר (התומך) התבצעה בו-זמנית עם ההזרעה הרגילה של הפרה בזרע פר אחר. על פי ניסיון שנים קודמות העגלים הנולדים מקורם מהפר של ההזרעה בלבד ולכן הסיכוי לקבלת תאומים הוא נמוך מאוד !


מטרות המחקר
1. לבדוק השפעת השתלה ביום 8-7, בלסטוציסטים פרתנוגנטיים (רבית בתולין) תומכים על שיעורי התעברות פרות חוזרות לעומת והשוואתן להזרעה מלאכותית רגילה
2. השוואה בשיעור התעברות פרות חוזרות על ידי תמיכה בלסתוציסטים פרתנוגנטים לעומת בלסתוציסטים שהתקבלו מהפריה בזרמה של פרים מובחרים (ביקורת). עוברים אלה הוקפאו לפי שיטת הזיגוג (Vitrification) (8,9) ויטריפקציה היא טכניקה להקפאה עמוקה שפותחה במחלקתנו. כל העוברים בני 8-7 ימים. כל ההשתלות 8-7 ימים לאחר ההזרעה
3. לבדוק שעורי התעברו לאחר השתלת השפעת השתלה עוברי IVF טריים (לא מוקפאים) בני 2 תאים מיד עם הזרעת פרות חוזרות.


חומרים בשיטות
השחלות הובלו מבית המטבחיים למעבדה בתמיסת saline בטמפרטורה של C°37. במעבדה, השחלות נחצו לשתיים בעזרת סכין מנתחים ונשטפו פעמיים בתמיסת saline. הביציות נשאבו מהזקיקים הגדולים 3-8mm בעזרת מחט18g אל תוך תמיסת HEPES-TALP בהמשך, הביציות
המטופלות עברו טפולים שונים: 1) מטורציה (24 שעות בתמיסות המיוחדות לכך). אקטיבציה של ביציות פרתנוגנטיות בתמיסת 6 -DMAP ו- Ionomicyn(לחלקת הביצית ללא תאי זרע).
2) מטורציה והפריה של הביצית בעוברים רגילים (IVF, in vitro fertilization). ביציות עברו הדגרה בתמיסת 199TCM למשך 22 שעות באינקובטור בתנאים סטנדרטים (C°38.4 , 5% CO2 ולחות יחסית של 95%). ביציות שעברו הדגרה הופרו בזרמה קפואה של פר ידוע וביציות פרטנוגנתי עברו לגידול בטיפות בנפח50µl של תמיסת cleavage medium , כעשרה עוברים בטיפה מכוסים בשמן מינרלי, בתנאים סטנדרטים. ביום 1 לאחר הפריה או חלוקה עברו העוברים לטיפות בנפח50µl של תמיסת IVF blastocyst medium כעשרה עוברים בטיפה מכוסים בשמן מינרלי בתנאים סטנדרטים עד שלב הבלסטוציסט (יום 7-8 לאחר הפריה או חלוקה) בשני סוגי הביציות. הביציות עברו ויטריפיקציה בקשיות מיוחדות לכך ומיד הוכנסו הקשית לחנקן נוזלי שקורר לטמפרטורה של (C°208–) באמצעות מכשיר ויטריפיקציה , (Vitmaster) על מנת להגביר את קצב הקירור. לאחר השלמת תהליך הזיגוג הקשיות עברו לאחסון במיכל חנקן נוזלי עד להפשרה.
ההפשרה של העוברים נעשת במשק עצמו ביום ההשתלה כשבוע ימים לאחר הזרעה מלאכותית, מהלך ההפשרה של הביציות נעשה לפי פירות הבא: הקשיות נחשפו לאוויר למשך שנייה ולאחר מכן הוכנסו הביציות לתמיסת הפשרה ( M0.6 בתמיסת PBS ) למשך 2 דקות ולאחריהן לתמיסות בריכוזים יורדים M0.5, M0.4, M0.3, M0.2, M0.1 וPBS- למשך 2 דקות בכל שלב. בהמשך עברו הביציות לתמיסתHolding Solution לפני ההשתלה. איכות הביציות המופשרות נקבע באמצעות הערכה מיקרוסקופית של אנשים מומחים לפני ההשתלה. ההשתלה נעשה באותו צד של הגוף הצהוב או איפה שהייתה ביוץ. בדיקת הריון נעשה ע"י רופא וטרינר של המשק כ-35 יום אחרי הזרעה. מיד לאחר ההמלטה נלקחו שערות מכל העגלים לבדיקת אבהות על פי פרופיל גנטי ידוע של האב בהזרעה המלאכותית בהזרעה מלאכותית לעומת האב של עוברי ה-IVF. כל הבדיקות בוצעו בחברת (בקטוכם נס-ציונה) על פי פרופיל הגנטי של ספר העדר ישראלי.


מהלך הניסוי בשנים 2009-2008

 


תוצאות:
בשנה 2008 התחלנו את ההשתלות ראשונות בקבוץ שובל שבנגב. עוברים IVF ועוברים פרתנוגנטים שיצרנו במעבדה ונשמרו בהקפאה, הושתלו 7-8 ימים אחרי ההזרעה יתר הפרות שימשו כביקורת לאותה תקופה. בדיקות הריון נעשו 35-40 יום אחרי ההזרעה.


PTN= partenogenetic
AI= Artificial Insemination
IVF=in vitro fertilization


טבלה מס' 1. קבוץ שובל שיעורי התעברות סיכום 2008


בטבלה מס' 1. קבוץ שובל שיעורי התעברות שנת (2008). קבוצות ניסוי, השתלת עוברים IVF אחרי הזרעה שלישית 57% (4/7), הזרעות 6-4 43% (3/7). השתלת עוברים פרטנוגנטים הזרעה שלישית 11% (1/11) הזרעות 6-4 33% (7/21) ממוצע השתלות 34% (15/44). קבוצת ביקורת 3 הזרעות 31% (7/37), 6-4 הזרעות 27% (22/83) ממוצע 24% (29/120).


טבלה מס' 2. קבוץ שובל שיעורי התעברות סיכום 2009


בטבלה מס' 2. קבוץ שובל (2009) שיעורי התעברות. קבוצות ניסוי השתלת עוברים IVF אחרי הזרעה שלישית 20% (2/10), הזרעות 6-4 17% (2/10). השתלת עוברים פרתנוגנטים הזרעה שלישית 23% (3/13) הזרעות 6-4 50% (2/4) ממוצע השתלות 24% (9/37). קבוצת ביקורת 3 הזרעות 23% (7/31), 6-4 הזרעות 27% (4/15) ממוצע 24% (11/46).


בטבלה מס' 3. קבוץ שובל סיכום ממוצע שיעורי התעברות שנים 2009-2008.


טבלה מס' 3. קבוץ שובל סיכום שנים .2009-2008 קבוצות ניסוי השתלת עוברים IVF אחרי הזרעה שלישית 50% (7/14), הזרעות 6-4 20% (4/20). השתלת עוברים פרטנוגנטים הזרעה שלישית 27% (8/30) הזרעות 6-4 29% (5/17) ממוצע השתלות 30% (24/81). קבוצת ביקורת 3 הזרעות 24% (29/120), 6-4 הזרעות 24% (11/46) ממוצע 24% (40/166).


טבלה מס' 4. קבוץ חפר שיעורי התעברות.


בטבלה מס' 4. קבוץ חפר סיכום שיעורי התעברות שנת 2009. קבוצות ניסוי השתלת עוברים IVF אחרי הזרעה שלישית 20% (1/5), הזרעות 6-4 30% (3/10). השתלת עוברים פרטנוגנטים הזרעה שלישית 10% (1/10) הזרעות 6-4 0% (0/8) ממוצע השתלות 15% (5/33). קבוצת ביקורת 3 הזרעות 33% (13/40), 6-4 הזרעות 16% (4/25) ממוצע 26% (17/65).


טבלה מס'. 5 קבוץ חוף השרון שיעורי התעברות, סיכום 2009


בטבלה מס' 5. קבוץ חוף השרון סיכום שיעורי התעברות שנת 2009. קבוצות ניסוי השתלת עוברים IVF אחרי הזרעה שלישית 25% (2/8), הזרעות 6-4 20% (1/5). השתלת עוברים פרטנוגנטים הזרעה שלישית 0% (0/5) הזרעות 6-4 20% (1/5) ממוצע השתלות 17% (4/23). קבוצת ביקורת 3 הזרעות 53% (9/17), 6-4 הזרעות 33% (5/15) ממוצע 44% (14/32).


טבלה מס' 6. סיכום כל הקבוצים שנים 2009-2008


בטבלה מס' 6. סיכום כל השנים. קבוצות ניסוי השתלת עוברים IVF 18/62 29%. השתלת עוברים פרטנוגנטים 15/75 20%. ביחד קבוצת IVF + פרטנוגנטים 33/137 24% וקבוצה ביקורת 71/263 27%. התוצאות מראות שסיכום כל הקבוצים ביחד, הייתה עליה קטנה בקבוצה IVF לעומת הביקורת.


טבלה מס' 7. שיעורי התעברות של פרות ומבכירות לאחר השתלת עוברים בני (שני תאים) ביום הזרעה בהשוואה לביקורת. בקיבוצים שובל, דורות, דביר ושומריה.


בטבלה מס' 7. סיכום השתלת עוברים שנת 2010. קבוצות ניסוי השתלת עוברים IVF בני יום (שני תאים) 4-3 הזרעות 13/28 46%, ביקורת 167/550 30%, קבוצות ניסוי 7-5 הזרעות 7/25 28%, קבוצות ביקורת 59/210 28%. סך כל ממוצע לקבוצות ניסוי (4-3 ו-7-5) 20/53 38% ולקבוצת ביקורת 226/760 30%. לקבוצות עם 2-1 הזרעות לא הושתלו עוברים רק מובאים התוצאות של הזרעות בלבד 325/777 41%.

 


דיון:
בשנת 2008 בקיבוץ שובל היו לנו תוצאות מאד טובות של השתלת עובר בלסטוציסט (IVF יום 7) התוצאות היו 7 הריונות מתוך 14 השתלות (50%) והיו טובות יותר מהשתלות עוברים פרתנוגנטיים. תוצאות בדיקת האבהות של העגלים שהתקבלו מתוך 7 ההריונות מעידות על השרשה של העוברים שהתקבלו מההזרעה ולא מעוברי הIVF- וכך גם ב-14 עגלים שנולדו מהשתלות שנעשו ב-2009 ס"ה 21 עגלים. לצערנו בשנת 2009 לא הצלחנו לחזור על ההצלחות של שנת 2008 ולכן החלטנו לעבור להשתלת עובר תומך בן יום. השיקולים היו בעיקר כלכליים וכרוכים בעומס עבודה על המשתילים ולוגיסטיקה ברפתות, כאשר מדובר בהשתלה של בלסטוציסט שבוע ימים לאחר ההזרעה. ההשתלות ב-2010 בוצעו לכן יחד עם ההזרעה מה שמוזיל את התהליך כולו והופך אותו ליעיל לוגיסטית בצורה משמעותית.
ניתן לראות מהתוצאות של 2010 שלמרות שהניסוי נפסק ולא הגענו למספר רב של השתלות, המגמה הייתה חיובית וקיבלנו אחוז התעברות גבוה במיוחד בהזרעות 3-4 (46%= 13 מתוך 28). אחוז התעברות של 46% (ממוצע מ4 משקי קיבוצים) הוא אף גבוה יותר מהממוצע של מבכירות ופרות בלתי חוזרות (בהזרעה 2-1) 41% במשקים בתקופה זו.
לסיכום השתלת עוברים משולב עם הזרעה מלאכותית מעלה שיעורי התעברות של פרות חוזרות. דרך הפעילות עדיין לא מובן לגמרה ונסתרך ניסויים נוספים.


ספרות:


1. Dochi O. Takahashi K, Hirai T, Hayakawa H, Tanisawa M, Yamamoto Y, Koyoma H. (2008) The use of embryo transfer to produce pregnancies un repeat-breeding dairy cattle. Theriogenology 69:124-128.
2. Gacitua, H., Zeron, Y., Segal, A., Dekel, I., Arav, A. (2009). Embryo transfer as a mean of increasing pregnancy rates in repear breeder cows. Annual Meeting of the European Association for Animal production (EAAP). p.408.
3. Kawarasaki T, Otake M, Tsuchiva S, Shibata M, Matsumoto K, Isobe N. (2009). Co-transfer of parthenogenotes and single porcine embryos leads to full-term development of embryos. Anim.Reprod Sci. 112:8-21.
4. Heyman Y, Chesne P, Chupin D, Menezo Y. (1987). Improvement of survival rate of frozen cattle blastocyst after transfer with trophoblastic vesicles. Theriogenology. 27:477-484.
5. Hashiyada, Okada M, Imai K. (2005). Transition of the pregnancy rate of bisected bovine embryos after co-transfer with trophoblastic vesicles prepared from in vivo-cultured in vitro-fertilized embryos.J.Reprod Dev. 51:749-756.
6. Imakawa K, Anthony RV, Kazemi M, Marotti KR, Polites HG, Roberts RM. (1987). Interferon-like sequence of ovine trophoblast protein secreted by embryonic trophectoderm. Nature. 330:377-379.
7. Roberts R.M. (20070. Interferon-tau a Type 1 interferon involved in maternal recognition of pregnancy. 18:403-408.
8. Yavin, S., Arav, A. (2001). Devlopment of immature bovine oocyte vitrified by the minimum drop size technique and a new vitrification apparatus (VitMaster). Cryobiology 43:331.
9. Yavin, S., Arav, A. (2002). Embryos cryopreservation in the presence of low concentration of vitrification solution by Sealed Pulled Straw (SPS) and VitMaster Human Reproduction 17 (Suppl.1): 125.

לכל המבזקים....
office@milk.org.il פקס: 972-3-9564766 טל: 972-3-9564750 דרך החורש 4 , ת"ד 97, יהוד 5647003
מופעל באמצעות מעוף - מגוון אפקט