דו"ח סופי לתוכנית מחקר מס'  362-0159-08

 

השפעת זירלנון (Zearalenone) על הפעילות השחלתית בבקר לחלב

 

עוזי מועלם, המחלקה לבקר, המכון לבעלי חיים, מינהל המחקר החקלאי.

משה קאים, המחלקה לבקר, המכון לבעלי חיים, מינהל המחקר החקלאי.

אריה שור, המחלקה לפתולוגיה וחקר הורמונים, המכון הווטרינרי.

 

  

תקציר

ידוע כי חומרים רבים בעלי מבנה כימי דמוי אסטרוגן המכילים קבוצה פנולית, עלולים לגרום לשיבושים במערכת הרבייה אצל בעלי חיים שונים. מנגנון הפעולה של חומרים אלה יכול להיות דרך: 1) חיקוי פעילות אסטרוגנית ע"י קשירה לרצפטורים אסטרוגניים, 2) פעילות אנטי-אסטרוגנית בגין חיקוי חלקי של הפעולה האסטרוגנית, 3) הגברת הפעילות האסטרוגנית ע"י עיכוב אנזימים המתקשרים לאסטרוגנים ברחם ומדכאים את פעילותם. הזירלנון נקשר לירידה בפוריות במס' בעלי חיים כגון: חזירים, בקר ועופות. לזירלנון יוחסו אפקטים של ירידה בשיעור ההתעברות והגדלת שיעור ההפלות בבקר. כמו כן יוחסה לזירלנון השפעה על התפתחות  ציסטות. באחת מן העבודות נמצא כי אצל עגלות שהוזנו ברמות מעל 12.5 ppm זירלנון ליום, נמצאה ירידה בשיעור ההתעברות. כמו כן בעדר בקר לחלב שהוזן בחציר מעופש עם ריכוזים גבוהים של זירלנון נמצאה ירידה בשיעורי ההתעברות. בעבודת מחקר זו אנו מציעים לבחון באופן מבוקר את השפעת האכלה של כמויות מבוקרות של זירלנון על מערכת הרבייה בבקר לחלב. במחקר זה ביצענו ניסוי מבוקר ברפת ההזנה הפרטנית של מכון וולקני ובו השתתפו 12 פרות מתחלובה שנייה ואילך. 6 פרות שימשו כקבוצת ביקורת והוזנו במנה הסטנדרטית, ו- 6 פרות נוספות שימשו כקבוצת טיפול וקיבלו 5 מ"ג ליום זירלנון נקי שנרכש בסיגמא. הזירלנון עורבב עם כ- 20 גר' תירס גרוס והוגש לפרות באופן פרטני. מחזור הייחום של הפרות סונכרן והשחלות נסרקו פעמיים בשבוע במשך כ- 2 מחזורים רצופים. בתקופה זו תועדו כל הזקיקים שהופיעו על השחלות, גופים צהובים וכן כל מופע אבנורמלי שנראה על השחלות. במהלך המחזור השלישי נשאב נוזל פוליקולרי מזקיקים פרהאובולטוריים. דגימות דם נלקחו אחת לשבוע וסביב הייחום נלקחו דגימות דם אחת ליום למעקב אחר ריכוזי האסטרדיול. לא נמצאו הבדלים בדינמיקה של זקיקים קטנים ובינוניים בשחלות בין שתי הקבוצות ואולם נמצא כי שיעור ההופעה של זקיקים שקוטרם מעל 15 מ"מ היה גדול יותר בקבוצת הזירלנון לעומת קבוצת הביקורת. כמו כן נמצא כי קוטרם ונפחם של הזקיקים הפרהאובולטוריים היה גדול יותר, בקבוצת הזירלנון לעומת קבוצת הביקורת, אם כי לא באופן מובהק. בשנה האחרונה השלמנו את האנליזות בזקיקים ולא נמצאו הבדלים מובהקים בריכוזי האנדרוסטנדיון, הפרוגסטרון והאסטרדיול בזקיקים. תכולת האסטרדיול בזקיקים מקבוצת הזירלנון הייתה פי שניים מאשר בקבוצת הביקורת (P<0.1), וכמו כן תכולת האנדרוסטנדיון והפרוגסטרון. ריכוזי הפרוגסטרון בפלסמה ביום 14 למחזור הייתה נמוכה יותר בקבוצת הזירלנון מאשר בקבוצת הביקורת (3.25 לעומת 6.55 נ"ג/מ"ל, בהתאמה). בבדיקה של ריכוזי האסטרדיול בפלסמה סביב הייחום לא נמצאו הבדלים בין קבוצת הביקורת לקבוצת הזירלנון. ממצאי עבודה זו מראים על הבדלים בהפרשת ההורמונים הסטרואידים בשחלות פרות שהוזנו במינונים מבוקרים. שינויים אלה באו לידי ביטוי חלקי בריכוזי הפרוגסטרון בפלסמה, אבל לא בריכוזי האסטרדיול. בגלל העלויות הגבוהות של החומר והעבודה האינטנסיבית שהייתה כרוכה במחקר זה, הניסוי נעשה על מדגם של 12 פרות בלבד. ניתן להניח כי במדגם גדול יותר היינו מקבלים תוצאות מובהקות סטטיסטית במרבית הפרמטרים שנבדקו.

 

מבוא ותיאור הבעיה

חומרים בעלי מבנה כימי דמוי אסטרוגן המכילים קבוצה פנולית, עלולים לגרום לשיבושים במערכת הרבייה. מקורם של חומרים אלה יכול להיות צמחי (פיטואסטרוגנים) או פטרייתי (מיקוטוקסינים) מנגנון הפעולה האפשרי של חומרים:

1) חיקוי פעילות אסטרוגנית ע"י קשירה לרצפטורים אסטרוגניים.

2) פעילות אנטי אסטרוגנית ע"י חיקוי חלקי של הפעולה האסטרוגנית.

3) הגברת הפעילות האסטרוגנית ע"י עיכוב פעילותם של אנזימים הנקשרים לאסטרוגנים ברחם ומדכאים את פעילותם.                                                      

המיקוטוקסינים החשובים ביותר זירלנון, אפלטוקסין, DAS (וומיטוקסין) ופומוניסין. בעבודה זו נבחן באופן מבוקר את השפעתו של הזירלנון על מערכת הרבייה בבקר.

הזירלנון בדומה לאסטרדיול מכיל טבעת פנולית ולכן מחקה את פעילותו.

למרות שנוטים לייחס לזירלנון השפעות שליליות על מערכת הרבייה בבקר, הנושא לא נחקר דיו ומעט מאוד עבודות מבוקרות מופיעות בספרות.

הזירלנון הינו מיקוטוקסין המופרש ע"י הפטריותculmorum Fusarium   ו-graminearum Fusarium   פטריות אלה נמצאות בצמחים ובקרקעות שונים. קיימים מס' תנאים הנחוצים לצמיחת הפטריות, אבל המכניזם להתרבותם עדיין לא ברור לגמרי. ייצור המיקוטוקסין ע"י הפטרייה מושפע מאוד מתנאי מזג אוויר ואקלים, וכן הרגישות למיני הטוקסינים שונה מאוד מאזור אחד לשני.

הפוזריום יכולה לייצר גם מינים נוספים של מיקוטוקסינים שאינם דמויי אסטרוגן כגון: דיאוקסיולנול ו- T-2. אי לכך יש להתחשב בכך שזיהום פטרייתי מסוג זה יכול להיות מולטיפקטוריאלי.    

 

סימפטומים קליניים המיוחסים לזירלנון

   כפי שצוין לעיל, בספרות נוטים לייחס לזירלנון השפעות שליליות על מערכת הרבייה. התופעות השליליות המיוחסות לזירלנון הן: ירידה בפוריות, מחזורי ייחום לא נורמליים, נפיחות בבושת, דלקת הוגינה, ירידה בתנובת חלב והגדלה של בלוטת העטין. לעתים נצפו תופעות שליליות אלה בו זמנית. השינויים במחזור המיני יכולים להיות במספר וריאציות: מחזורים ארוכים, חוסר תאנה, או מחזורים לא סדירים הם התופעות הנקשרות לזירלנון. למרות שהפרעות אלה במחזור הייחום אינן ייחודיות לזירלנון, באם יש תדירות גבוהה של התופעה בעדר יש לבדוק את ריכוזי הזירלנון במזון. באחד הדיווחים מעדר עם 150 ראש, נמצאה ירידה בפוריות עם ההזנה במזון מעופש. נמצאו ריכוזים של 14 מ"ג לק"ג של זירלנון בחציר. לאחר הסרה של החציר המעופש מן המזון, העדר חזר לרמת הפוריות הרגילה שלו. בעדר נוסף שמנה 20 פרות ונמצא בו שיעור גבוה של פרות עם חוסר תאנה, ציסטות נימפומניות וייחומים ללא ביוץ נורמלי, נמצאו ריכוזים גבוהים של זירלנון בחציר התירס (ppm 50) ובתחמיץ (ppm 100).  לפי חישוב נמצא כי הפרות בעדר זה צרכו בממוצע כ- 1.6 מ"ג של זירלנון ליום.

בעדר נוסף שבו נמצאו שיבושים במחזור המיני, נמצא כי ריכוזי הזילרנון היו כ- 25 מ"ג לק"ג.

התופעות הקליניות של זירלנון בעגלות הינן שונות מאשר בפרות. הגדלה של רקמת העטין, נפיחות בבושת ודלקת הנרתיק הן תופעות נפוצות יותר בעגלות מאשר בפרות. בעדר שבו הוזנו עגלות בתירס מעופש, העגלות פיתחו בלוטת חלב מוגדלת בלפחות רבע אחד. אובחנו ריכוזים גבוהים של זירלנון בתירס המעופש, ו- 7 שבועות לאחר הסרה של התירס המעופש, כל העגלות חזרו למצב תקין.

Weaver (1986) דיווח שכאשר ריכוזי הזירלנון במזון עלו על ppm 12.5 יש סבירות גבוהה לפגיעה בשיעורי ההתעברות אצל עגלות.

   ההשפעות השליליות של זירלנון שונות מאוד מגזע לגזע, גיל ותנאי הסביבה. למרות שרוב הסימפטומים הידועים נובעים מחיקוי פעילותו של האסטרוגן, לא ניתן לצפות איזה תופעה קלינית  תבוא לידי ביטוי בקבוצת בעלי חיים מסויימת. יכול להיות שתופעות תת-קליניות בלתי מאובחנות באות לידי ביטוי עם הזירלנון. ככל הנראה שילוב של פקטורים גנטיים וסביבתיים הם אלה הקובעים את מידת השפעתו של הזירלנון על בעל חיים מסויים.

  כפי שדווח לעיל, מעט מאוד עבודות מבוקרות בחנו את השפעת הזירלנון בבקר.  בעבודה מבוקרת של Minervini et al, 2001 נאספו משחלות של פרות מבית מטבחיים, הודגרו בנוכחות ריכוזים שונים של זירלנון ונגזרותיו. הביציות עברו הבגרה in-vitro (IVM), ונבחנה התפתחות הביציות. תוצאות עבודה זו מופיעות בטבלה מס' 1.  מן הטבלה ניתן לראות שככל שריכוז הזירלנון עלה שיעור הביציות האבנורמליות עלה מ- 0% בריכוז ללא זירלנון ועד ל- 60% בריכוזים של µg/ml 30 . כמו כן הביציות נעצרו בשלבי מיוזה מוקדמים יותר ככל שריכוז הזירלנון הלך ועלה.

 

טבלה מס' 1. השפעת הדגרה של ביציות בקר בריכוזים שונים של זירלנון על התפתחות הביצית.

 

 

מעבודות אלה שנעשו in vitro ניתן לראות את השפעתו השלילית של זירלנון על איכות ביציות ועוברים בבקר. ככל הנראה פגיעה זו בהתפתחות הביצית והעובר היא הגורם לפגיעה בפוריות אצל פרות עם בהזנה עם מינונים גבוהים של זירלנון.

    בעדרים רבים בישראל קיימת בעיה של פוריות נמוכה. ברבים מן המקרים לא ניתן לבודד את הגורם לירידה בפוריות או ריבוי פרות עם חוסר תאנה או ציסטיות שחלתיות. בגלל הבעייתיות הקיימת בדיאגנוזה וניטור של ריכוזי הזירלנון במזון, לא תמיד מייחסים את הירידה בפוריות לנוכחות חריגה של זירלנון במזון, למרות שקיימת אפשרות כזאת. ריכוזים גבוהים של זירלנון עלולים להגיע למנת פרת חלב ע"י הזנה בחציר או בתחמיץ מעופשים, או במקרים נדירים יותר הזנה בגרעינים שזוהמו בפוזריום. בעבודת מחקר זו נבחן את השפעתו השלילית של זירלנון על הפעילות השחלתית בבקר ונבסס את הידע הקושר בין ריכוזי זירלנון גבוהים במזון ותופעות שליליות במערכת הרבייה של בקר לחלב.

 

מטרת המחקר

מטרת המחקר היא לבחון השפעת מתן זירלנון במינונים מבוקרים, על הפעילות  השחלתית בבקר לחלב.

 

מבנה הניסוי

   הניסוי נערך ברפת הניסיונות של מכון וולקני, ובו השתתפו 12 פרות מתחלובה שנייה ואילך. בתחילת הניסוי נבדקו הפרות בעזרת אולטרסאונד לתקינות מערכת המין ומחזוריות תקינה. פרות שנמצאו תקינות ומחזוריות השתתפו בניסוי. הפרות חולקו לפי תנובת חלב, ימים בתחלובה ומס' תחלובה.

לאחר תקופת הסתגלות של כ- 10 ימים לרפת ההזנה הפרטנית, מחזור הייחום של הפרות סונכרן ע"י 2 זריקות PG בהפרש של 14 יום לפני מתן הטיפול התזונתי. כ- 48 שעות לאחר זריקת ה- PG השנייה שהוא מועד הייחום הצפוי התחיל מתן הטיפול התזונתי. פרות קבוצת הביקורת הוזנו במנת העדר הרגילה. קבוצת הטיפול קיבלה את מנת הביקורת בתוספת יומית של 5 mg זירלנון שניתן באופן פרטני. הזירלנון עורבב עם 20 גרם תירס גרוס וניתן עם ההאבסה.

מיום תחילת הטיפול התזונתי השחלות נסרקו פעמיים בשבוע והזקיקים מגודל של 2 מ"מ ואילך נמדדו ונספרו, ותועדו במפות של כל שחלה בנפרד. הפרות נסרקו פעמיים בשבוע במשך 2 מחזורי ייחום רצופים וביום 15 של המחזור השני הפרות קיבלו זריקת PG. 48 שעות לאחר מתן ה- PG נשאבו זקיקים שקוטרם מעל 6 מ"מ. שאיבת הנוזל הפוליקולרי נעשתה על ידי שימוש בטכניקה של שאיבת ביציות בבקר תחת הרדמה אפידורלית. בטכניקה זו תחילה הוזרק לפרה 1 ml של רומפון 2 לשם הרגעה, ולאחר מכן הוזרק 5 ml  עזרקאין (Esracain 2%, Lidocaine HCl 2%, 200mg/10ml) לחלל האפידורלי מעל בסיס הזנב. בעת השאיבה הוחדר מתמר וגינאלי אשר דרכו עובר צינור מוביל ובקצהו מחט חד פעמית בקוטר 18G, דרכה נאסף הנוזל הפוליקולרי לתוך מבחנה בעזרת משאבת ואקום. כל זקיק נשאב למבחנה נפרדת, סומן והועבר מיידית לקירור. לאחר מכן הנוזל הפוליקולרי סורכז למשך 25 דקות והוקפא להמשך אנליזות. בנוזל הפוליקולרי ייקבעו ריכוזי  אנדרוסטנדיון, אסטרדיול ופרוגסטרון.

דגימות דם נלקחו פעם בשבוע מתחילת הטיפול התזונתי ועד תום הניסוי.

במחזור הייחום השני נלקחו דגימות דם אחת ליום החל ממועד הזרקת ה- PG השני ועד תום הייחום לקביעת ריכוז אסטרדיול בפלסמה.

 

תוצאות ודיון

בוצע ניתוח של הדינמיקה של הזקיקים בשחלות וגודלם ונפחם של הזקיקים הפאראובולטורי שנשאבו מן השחלה. הזקיקים שתועדו על פני השחלות חולקו לקטגוריות הבאות:

a -  2-5 מ"מ     b – 6-9 מ"מ    c -  10-14 מ"מ    d – 15< מ"מ. להלן התוצאות.  

 

תרשים מס' 1. הדינמיקה של זקיקים שקוטרם 2-5 מ"מ בשחלות במהלך המחזור המיני

 

 

תרשים מס' 2. הדינמיקה של זקיקים שקוטרם 6-9 מ"מ בשחלות במהלך המחזור המיני

 

 

תרשים מס' 3. הדינמיקה של זקיקים שקוטרם 15< מ"מ בשחלות במהלך המחזור המיני

 

כפי שנראה מתרשימים 1 ו- 2 לא נמצאו הבדלים במס' הזקיקים הקטנים והבינוניים בשחלות בין פרות הביקורת ופרות שקבלו תוספת זירלנון. לעומת זאת מס' הזקיקים שגודלם מעל 15 מ"מ כפי שנראה בתרשים מס' 3 היה גדול יותר והבדל זה נמצא מובהק  (P < 0.01). 

   בתרשימים מס' 4 ו- 5 מוצגים הקוטר והנפח של זקיקים פרה-אובולטוריים כפי שנמדדו 48 שעות לאחר הזרקת PG שני.

 

תרשים מס' 4. קוטרו של הזקיק הפרהאובולטורי

 

תרשים מס' 5. נפחו של הזקיק הפרהאובולטורי

 

כפי שנראה משני תרשימים אלה גם קוטרו וגם נפחו של הזקיק הפרהאובולטורי היה גדול יותר אצל פרות שקיבלו זירלנון. הקוטר הממוצע של הזקיקים הפרהאובולטוריים של קבוצת הביקורת היה 15.4 מ"מ לעומת 19.4 מ"מ בקבוצת הזירלנון (P < 0.24). נפחם הממוצע של הזקיקים הפרהאובולטוריים מקבוצת הביקורת היה 2.6 סמ"ק לעומת 5.5 מ"מ בקבוצת הזירלנון (P < 0.16).

 

ריכוזי ותכולת הסטרואידים בנוזל פוליקולרי שנשאב מזקיקים קדם-ביוציים

לא נמצאו הבדלים בריכוזי האנדרוסטנדיון והפרוגסטרון בזקיקים בין הטיפולים ואולם ניתן לראות הבדלים (לא מובהקים) בתכולת האנדרוטנסדיון (תרשים מס' 6) והפרוגסטרון (תרשים מס' 7) בין שני הטיפולים.

 

תרשים מס' 6. תכולת האנדרוסטנדיון בזקיקים פרהאובולטוריים

 

תרשים מס' 7. תכולת הפרוגסטרון בזקיקים פרהאובולטוריים

 

 

 

כמו כן לא נמצאו הבדלים מובהקים בריכוזי האסטרדיול בזקיקים בין הטיפולים (1360.8 בקבוצת הביקורת לעומת 1517.9 ng/ml בקבוצת הזירלנון). אבל כפי שניתן לראות בתרשים מס' 8 תכולת האסטרדיול הייתה מעל פי שניים בקבוצת הזירלנון לעומת קבוצת הביקורת.

 

תרשים מס' 8. תכולת האסטרדיול בזקיקים פרהאובולטוריים

 

 

 

   תוצאות הניסוי מראות כי מס' הזקיקים הגדולים על השחלה היה גדול יותר אצל פרות שקיבלו זירלנון, וכן גודלו ונפחו של הזקיק הפרהאובולטורי היה גדול יותר אם כי לא באופן מובהק. כמו כן נמצאו תכולות גדולות יותר של ההורמונים הסטרואידים בנוזל הפוליקולרי של פרות שקיבלו זירלנון לעומת פרות הביקורת. הבדלים בולטים היו בעיקר בריכוזי האנדרוסטנדיון והאסטרדיול בין הטיפולים.

בתרשים מס' 9 מוצגים ריכוזי האסטרדיול בפלסמה סביב הייחום. למרות שנמאו ריכוזים גבוהים יותר של אסטרדיול בזקיקים פרהאובולטוריים בקבוצת הזרלינון, הבדלים אלה לא באו לידי ביטוי בפלסמה.

 

תרשים מס' 9. ריכוז האסטרדיול בפלסמה סביב הייחום

 

כתוצאה מעלויות גבוהות של החומר הנבדק, ומבנה הניסוי הדורש עבודה אינטנסיבית, עבדנו על מדגם של 12 פרות. במדגם זה נמצאו הבדלים מספריים גדולים במספר פרמטרים וקרוב לודאי שעם מספר רב יותר של פרטים תוצאות אלה היו מובהקות סטטיסטית. ניתן לראות כי בהשפעת הזירלנון נמצאו שינויים בדינמיקה של הזקיקים בשחלות וכן בהפרשת הסטירואידים בזקיקים פרהאובולטוריים. הבדלים אלה באו לידי ביטוי חלקי בריכוזי הפרוגסטרון, אבל לא בריכוזי האסטרדיול בפלסמה.

 

רשימת ספרות

1. Abramson et al: 1997.  Mycotoxins in Fungal Contaminated Samples from Animal Feed from Western Canada, 1982-1994.  Canada J of Vet Research 61:49-52.

2) Diekman M and Green M: 1992.  Mycotoxins and Reproduction in Domestic Livestock. J of Anim Sci 70 : 1615-1627.

3)  Osweiler et al: 1985.  Clinical and Diagnostic Veterinary Toxicology, 3rd ed. 410-436

4)  Schuh M: 1997.  Clinical and Subclinical Events Related to the Presence of Mycotoxins in Cattle Feed.  Israel J of Vet Med 52: 93-97.

5) Sharma R and Dattajiao S: 1991.  Mycotoxins and Phytoalexins.  36-40.

6) Weaver et al: 1986.  Effect of Zearalenone on Dairy Cows.  Am J of Vet Research 47: 1826-1828.

7)   Whitlow et al: 1998.  Mycotoxin Occurrence in Farmer Submitted Samples of North Carolina Feedstuffs: 1989-1997.  J of Dairy Science 81,4: 1189.

8) Shemesh, M. and L. S. Shore. 1987. Non-estradiol oestrogens of dietary origin: activity, distribution and mechanism. Isr. J. Vet. Med. 43:192.

9) Minervini, F., M. E. Dell'Aquila, F. Maritato, P. Minoia, and A. Visconti. 2001. Toxic effects of the mycotoxin zearalenone and its derivatives on in vitro maturation of bovine oocytes and 17ß-estradiol levels in mural granulosa cell cultures. Toxicology in vitro 15:489-495.

10) Collins, T. F. X., R. L. Sprando, T. N. Black, N. Olejnik, R. M. Eppley, H. Z. Alam, J. Rorie, D. J. Ruggles. 2006. Effects of zearalenone on in utero development in rats. Food and Chemical Toxicology 44:1455-1465.

 

 

 

לכל המבזקים....
office@milk.org.il פקס: 972-3-9564766 טל: 972-3-9564750 דרך החורש 4 , ת"ד 97, יהוד 5647003
מופעל באמצעות מעוף - מגוון אפקט